白穎慧，杜子亮，陳 書(shū)，魯碧楠，龐宗然Δ

(1.中央民族大學(xué)中國(guó)少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，中國(guó)少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081;2.北京市回民醫(yī)院，北京 100053)

菩人丹改善高糖波動(dòng)狀態(tài)下INS-1細(xì)胞胰島素分泌功能的分子機(jī)制*

白穎慧1，杜子亮2，陳 書(shū)1，魯碧楠1，龐宗然1Δ

(1.中央民族大學(xué)中國(guó)少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，中國(guó)少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081;2.北京市回民醫(yī)院，北京 100053)

目的:考察菩人丹改善高糖波動(dòng)狀態(tài)下INS-1細(xì)胞胰島素分泌功能的分子機(jī)制。方法:將INS-1細(xì)胞置于含33.3 mmol ·L－1和11.1 mmol·L－1葡萄糖RPMI1640培養(yǎng)液內(nèi)12 h交替培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)5 d構(gòu)建高糖波動(dòng)細(xì)胞模型。分別以5%、10%菩人丹含藥血清對(duì)高糖波動(dòng)狀態(tài)下INS-1細(xì)胞干預(yù)24 h，并以二甲雙胍含藥血清作為陽(yáng)性對(duì)照。正常對(duì)照組細(xì)胞以含11.1 mmol·L－1葡萄糖的RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。采用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力，大鼠胰島素ELISA試劑盒測(cè)定胰島素分泌量，Western blot分析IRS2、Akt、mTOR、P70s6k和PTP1B的蛋白質(zhì)表達(dá)水平及磷酸化水平。結(jié)果:與正常組比較，高糖波動(dòng)能夠顯著降低INS-1細(xì)胞活力及胰島素分泌量，下調(diào)INS-1細(xì)胞的IRS2蛋白質(zhì)表達(dá)水平，提高IRS2磷酸化水平，降低INS-1細(xì)胞Akt、mTOR和P70s6k的磷酸化水平，上調(diào)PTP1B蛋白質(zhì)表達(dá)水平。與模型組比較，菩人丹含藥血清能增加INS-1細(xì)胞活力及胰島素分泌量，上調(diào)IRS2蛋白質(zhì)表達(dá)，抑制IRS2磷酸化，促進(jìn)Akt、mTOR和P70s6k的磷酸化，下調(diào)PTP1B蛋白表達(dá)水平。結(jié)論:菩人丹調(diào)控高糖波動(dòng)誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞IRS2、Akt、mTOR、P70s6k和PTP1B的蛋白質(zhì)表達(dá)水平及磷酸化水平，改善高糖波動(dòng)狀態(tài)下胰島β細(xì)胞胰島素分泌功能。

INS-1細(xì)胞;高糖波動(dòng);胰島素分泌;菩人丹;IRS2-PI3K/Akt

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的主要病理表現(xiàn)是糖脂代謝紊亂，而血糖水平的急性改變是T2DM患者糖代謝紊亂的重要形式。研究已證實(shí)［1-3］，高糖狀態(tài)下的血糖波動(dòng)通過(guò)激活氧化應(yīng)激、炎癥通路等方式，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞數(shù)量異常減少和胰島素分泌功能的下降，致使胰島β細(xì)胞無(wú)法分泌足夠的胰島素以調(diào)節(jié)機(jī)體血糖穩(wěn)態(tài)，從而加速T2DM的發(fā)生發(fā)展。因此，保護(hù)高糖波動(dòng)(fluctuatedhigh glucose，F(xiàn)G)狀態(tài)下胰島β細(xì)胞功能，是減緩T2DM病程的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)以大鼠胰島素瘤細(xì)胞系INS-1細(xì)胞為研究對(duì)象，體外模擬高糖波動(dòng)狀態(tài)下胰島β細(xì)胞分泌功能的變化，考察中藥降糖復(fù)方菩人丹(Pu Ren Dan，PRD)對(duì)胰島β細(xì)胞胰島素分泌的影響，并以胰島素受體底物2/磷酸肌醇-3激酶/蛋 白 激 酶 B (insulin receptor substrate 2/ phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，IRS2-PI3K/Akt)信號(hào)通路為切入點(diǎn)，探討菩人丹改善糖波動(dòng)狀態(tài)下INS-1細(xì)胞胰島素分泌功能的分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株

大鼠胰島素瘤細(xì)胞系INS-1細(xì)胞株，購(gòu)自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心;SPF級(jí)雄性Wistar大鼠90只，8周齡，體質(zhì)量300 g左右，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(SCXK-軍2007-004)。

1.2 主要藥品及試劑

人參(亞威中藥飲片有限公司)、丹參(金香中藥飲片有限公司)、葛根(金香中藥飲片有限公司)、制何首烏(亞威中藥飲片有限公司)、制水蛭(金香中藥飲片有限公司)、苦瓜凍干粉(諾金科生物技術(shù)有限公司)、鹽酸二甲雙胍片(雙鶴藥業(yè))、Cell Counting Kit-8(CCK-8)(DOJINDO同仁化學(xué)研究所)、大鼠胰島素ELISA試劑盒(RD Biosciences公司)、p-IRS2(ser731)、IRS2、p-Akt(thr308)、p-mTOR (ser2448)、p-P70s6k(thr389)(CellSignaling Technology公司)、PTP1B(Millipore公司)。

1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái)(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司)，血球計(jì)數(shù)板(上海求精公司)，多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)分子儀器公司)，Bio-Rad電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)儀器有限公司)，水平脫色搖床(江蘇其林貝爾儀器有限公司)，濕轉(zhuǎn)電泳槽(北京凱元信瑞儀器有限公司)，F(xiàn)resco低溫冷凍離心機(jī)(美國(guó) Thermo Scientific公司)。

1.4 菩人丹含藥血清制備

1.4.1 中藥菩人丹制備 菩人丹降糖方由苦瓜、人參、丹參、制首烏、葛根及水蛭組成。將人參、丹參、制首烏、葛根及水蛭以冷水浸泡過(guò)夜后，加8倍水回流提取2次，時(shí)間為1.5、1 h，其中人參單獨(dú)提取，余藥材一并提取，收集提取液過(guò)濾后合并，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮。取苦瓜凍干粉加入之前藥材濃縮液中，蒸餾水補(bǔ)齊，制備濃度相當(dāng)于生藥量7.21 g ·mL－1的菩人丹。

1.4.2 菩人丹含藥血清制備 取SPF級(jí)雄性Wistar大鼠90只，8周齡，體質(zhì)量(300 g±10 g)，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，即菩人丹組30只，二甲雙胍陽(yáng)性對(duì)照組30只和空白對(duì)照組30只，各組均飼以普通維持飼料。根據(jù)前期研究結(jié)果［8-13］，確定大鼠給藥體質(zhì)量劑量為正常給藥劑量的10倍，即菩人丹組以144.2 g(生藥)·kg－1·d－1水煎液灌胃，二甲雙胍陽(yáng)性對(duì)照組以1.4 g·kg－1·d－1的二甲雙胍0.5%CMC-Na乳濁液灌胃;空白對(duì)照組以0.5%CMC-Na溶液灌胃。各組大鼠的灌胃體積為10 mL·kg(體質(zhì)量)－1，每日給藥2次(間隔12 h)，連續(xù)給藥5 d。第5天首次給藥(即第9次給藥)后1 h，腹腔注射10%水合氯醛(體質(zhì)量劑量3 mL·kg－1)麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，血樣室溫靜置3 h，3500 rpm離心15 min取上清，分別將各組大鼠血清混合，56℃水浴滅活30 min，一次性無(wú)菌微孔濾膜(0.22 μm)過(guò)濾滅菌，分裝后－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

INS-1細(xì)胞在完全RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，葡萄糖11.1 mmol·L－1，1 mmol·L－1丙酮酸鈉，2 mmol·L－1L-谷氨酰胺，10 mmol·L－1HEPES，50 μmol·L－1β-巰基乙醇，100 kU/L青霉素，100 mg/L鏈霉素)中培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后予以傳代。

2.2 模型復(fù)制及分組

取同代 INS-1細(xì)胞置于含33.3 mmol·L－1和11.1 mmol·L－1葡萄糖的RPMI1640培養(yǎng)液內(nèi)12 h交替培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)5 d。將INS-1細(xì)胞等密度接種于培養(yǎng)板中，待細(xì)胞完全貼壁后隨機(jī)分組并進(jìn)行干預(yù):正常對(duì)照組(Control組，常規(guī) RPMI1640中培養(yǎng))、高糖波動(dòng)模型組(FG組，高糖RPMI1640培養(yǎng)液與常規(guī)RPMI1640中交替培養(yǎng)5 d，每12 h交替，后以常規(guī)RPMI1640培養(yǎng)24 h)、菩人丹藥物血清高劑量組(H-PRD組，F(xiàn)G組細(xì)胞中加入終濃度10%的菩人丹含藥血清常規(guī)RPMI1640培養(yǎng)液干預(yù)24 h)、菩人丹藥物血清低劑量組(L-PRD組，F(xiàn)G組細(xì)胞中加入終濃度5%的菩人丹含藥血清常規(guī)RPMI1640培養(yǎng)液干預(yù)24 h)、二甲雙胍藥物血清對(duì)照組(MF組，F(xiàn)G組細(xì)胞中加入終濃度10%的二甲雙胍含藥血清培養(yǎng)液干預(yù)24 h)。

2.3 細(xì)胞活力檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的INS-1細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×105cells·mL－1并接種于96孔板，每孔200 μL，于5%CO2、37℃恒溫濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(A)，以Control組A為對(duì)照，按照干預(yù)組A/正常組A×100%計(jì)算各組細(xì)胞活力。

2.4 葡萄糖刺激的胰島素釋放實(shí)驗(yàn)

將INS-1細(xì)胞按2×105/孔的密度接種于24孔板中培養(yǎng)到80%～90%融合，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2遍后，加入含有3 mmol·L－1葡萄糖的Krebs-Ringer HEPES緩沖液(KRBH緩沖液，含有 115 mmol·L－1氯化鈉，24 mmol·L－1碳酸氫鈉，5 mmol· L－1氯化鉀，1 mmol·L－1氯化鎂，25 mmol·L－1HEPES，0.5%BSA，pH 7.4)，在37℃下平衡20 min棄去上清，分別加入含3 mmol·L－1或20 mmol·L－1葡萄糖的KRHB緩沖液，37℃孵育20 min，小心吸取上清液(注意盡量不要吸到細(xì)胞)后4℃離心800 rpm，5 min，收集上清后采用ELISA法測(cè)定胰島素分泌量。相應(yīng)的細(xì)胞加200 μL細(xì)胞裂解液，BCA法測(cè)每組細(xì)胞總蛋白含量。每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)復(fù)孔，重復(fù)3次。通過(guò)總蛋白含量對(duì)胰島素釋放量進(jìn)行校正，計(jì)算出各組細(xì)胞的基礎(chǔ)胰島素分泌(basal insulin secretion，BIS)和葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS)。

2.5 Western blot分析

利用western blot分析檢測(cè)胰島素受體底物2 (insulin receptor substrate 2，IRS2)、蛋白激酶 B (protein kinase B，Akt)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、40S核糖體S6蛋白激酶(P70 ribosomal protein S6 kinases，P70s6k)和蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平及磷酸化水平。收集各組細(xì)胞，按RIPA蛋白抽提試劑盒說(shuō)明抽取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。制備蛋白樣品轉(zhuǎn)膜、封閉，置于一抗(p-IRS2 (ser731)1∶1000、IRS 1∶1000、p-Akt(thr308)1∶1000、p-mTOR(ser2448)1∶2000、p-P70s6k(thr389)1∶1000、PTP1B 1∶4000)中4℃過(guò)夜，次日置于二抗(1∶20000)中，搖床上室溫孵育40 min，ECL發(fā)光顯色，Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)對(duì)Western印跡目的條帶進(jìn)行掃描，然后用Quantity One軟件分析目的條帶光密度值與內(nèi)參條帶光密度值的比值來(lái)評(píng)估結(jié)果。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，2組間比較采用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 菩人丹對(duì)高糖波動(dòng)狀態(tài)下INS-1細(xì)胞的活力檢測(cè)

圖1顯示，采用CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞活力，結(jié)果顯示INS-1細(xì)胞在含33.3 mmol·L－1葡萄糖的培養(yǎng)液和含11.1 mmol·L－1葡萄糖的培養(yǎng)液中培養(yǎng)5 d后，細(xì)胞活力顯著降低，以常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞(細(xì)胞活力為100%)為對(duì)照，F(xiàn)G組細(xì)胞活力下降至(57.40% ±5.32%，P＜0.001)。分別給予低劑量(5%)和高劑量(10%)菩人丹含藥血清對(duì)高糖波動(dòng)損傷INS-1細(xì)胞進(jìn)行24 h干預(yù)，結(jié)果LPRD組與FG組的細(xì)胞活力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(60.40%±3.58%，P=0.275)，但H-PRD組作用24 h后，INS-1細(xì)胞活力較 FG組細(xì)胞明顯升高(80.00%±4.12%，P＜0.001)。

圖1 菩人丹對(duì)高糖波動(dòng)狀態(tài)下INS-1細(xì)胞的活力檢測(cè)注:與FG組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

3.2 菩人丹對(duì)高糖波動(dòng)狀態(tài)下INS-1胰島素分泌功能的影響

圖2顯示，利用ELISA方法對(duì)INS-1細(xì)胞的胰島素分泌量進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，INS-1細(xì)胞的基礎(chǔ)胰島素分泌量(BIS)由(0.77±0.07)μU/mg/h下降至(0.522±0.065) μU/mg/h(P＜0.001)，葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)則由(1.908±0.085)μU/mg/h降低至(0.61±0.117)μU/mg/h(P＜0.001);低劑量菩人丹干預(yù)24 h后，INS-1細(xì)胞的BIS與FG組比較無(wú)明顯改變，但GSIS顯著升高(0.826±0.065 μU/mg/ h，P=0.009);高劑量即菩人丹可以明顯增加INS-1細(xì)胞的胰島素分泌量，BIS增加至(0.692±0.006) μU/mg/h(P＜0.001)，GSIS增加至(1.21±0.123) μU/mg/h(P＜0.001)。

圖2 菩人丹對(duì)高糖波動(dòng)狀態(tài)下INS-1細(xì)胞胰島素分泌功能的影響注:與FG組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

3.3 菩人丹對(duì)INS-1細(xì)胞IRS2、Akt、mTOR、P70s6k和PTP1B的蛋白質(zhì)表達(dá)水平及磷酸化水平的影響

3.3.1 菩人丹對(duì)高糖波動(dòng)狀態(tài)下INS-1細(xì)胞IRS2蛋白質(zhì)表達(dá)及磷酸化的影響 圖3顯示，與Control組比較，F(xiàn)G組INS-1細(xì)胞的IRS2蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯下調(diào)(63.00% ±4%，P＜0.001)，菩人丹則能顯著上調(diào)高糖波動(dòng)狀態(tài)下?lián)p傷INS-1細(xì)胞的IRS2蛋白質(zhì)表達(dá)水平，菩人丹干預(yù)組細(xì)胞的IRS2蛋白質(zhì)表達(dá)水平與FG組比較升高(86.00%±4%，P＜0.001);與Control組比較，F(xiàn)G組IRS2(ser731)磷酸化水平升高(318.00% ±18%，P＜0.001)，菩人丹作用24 h后，損傷INS-1細(xì)胞IRS2(ser731)磷酸化水平顯著降低(72.00%±3%，P＜0.001)。

圖3 菩人丹對(duì)高糖波動(dòng)狀態(tài)下INS-1細(xì)胞IRS2蛋白質(zhì)表達(dá)及ser731位點(diǎn)磷酸化的影響注:與FG組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

圖4 菩人丹對(duì)高糖波動(dòng)狀態(tài)下INS-1細(xì)胞Akt(thr308)磷酸化的影響注:與FG組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

圖5 菩人丹對(duì)高糖波動(dòng)狀態(tài)下INS-1細(xì)胞mTOR(ser2448)和P70s6k(thr389)磷酸化的影響注:與FG組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

圖6 菩人丹對(duì)高糖波動(dòng)狀態(tài)下INS-1細(xì)胞PTP1B蛋白表達(dá)水平的影響注:與FG組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

3.3.2 菩人丹對(duì)高糖波動(dòng)狀態(tài)下INS-1細(xì)胞Akt(thr308)磷酸化的影響 圖4顯示，高糖波動(dòng)狀態(tài)下Akt蘇氨酸308位點(diǎn)磷酸化水平明顯降低，與Control組比較，F(xiàn)G組Akt(thr308)磷酸化水平下降(62%±2%，P＜0.001)。菩人丹可上調(diào)INS-1細(xì)胞Akt(thr308)磷酸化水平，促進(jìn)Akt活化。菩人丹作用24 h后，F(xiàn)G損傷細(xì)胞的Akt(thr308)磷酸化水平升高(70%±1%)。

3.3.3 菩人丹對(duì)高糖波動(dòng)狀態(tài)下INS-1細(xì)胞mTOR(ser2448)和P70s6k(thr389)磷酸化的影響圖5顯示，高糖波動(dòng)狀態(tài)下 INS-1細(xì)胞 mTOR (ser2448)的磷酸化水平顯著下降，F(xiàn)G組 mTOR (ser2448)磷酸化水平較 Control組下降(30% ± 5%，P＜0.001)，菩人丹作用24 h后，INS-1細(xì)胞mTOR(ser2448)磷酸化水平上調(diào)(48%±8%，P= 0.006)。作為mTOR效應(yīng)因子的P70s6k，其thr389位點(diǎn)的磷酸化在高糖波動(dòng)狀態(tài)下被顯著抑制;與Control組比較，F(xiàn)G組P70s6k(thr389)磷酸化水平下降(14%±4%，P＜0.001)，菩人丹作用24 h后，F(xiàn)G組細(xì)胞 P70s6k(thr389)磷酸化水平均顯著升高(58%±6%，P＜0.001)。

3.3.4 菩人丹對(duì)高糖波動(dòng)狀態(tài)下INS-1細(xì)胞PTP1B蛋白質(zhì)表達(dá)的影響 圖6顯示，高糖波動(dòng)狀態(tài)下，INS-1細(xì)胞的PTP1B蛋白質(zhì)表達(dá)顯著上調(diào)，與control組比較，F(xiàn)G組 PTP1B蛋白質(zhì)表達(dá)水平(126%±8%，P=0.002)，菩人丹作用24 h后，F(xiàn)G損傷細(xì)胞PTP1B蛋白表達(dá)水平下調(diào)(64%±10%，P＜0.001)。

4 討論

血糖波動(dòng)不僅是糖尿病慢性并發(fā)癥重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而且與胰島β細(xì)胞功能密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，血糖水平波動(dòng)較大時(shí)β細(xì)胞功能減低明顯高于較小的血糖水平波動(dòng)，提示胰島β細(xì)胞功能損害的嚴(yán)重程度與血糖波動(dòng)幅度的大小有關(guān)。邱平等［10］通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明，波動(dòng)性高糖可顯著降低細(xì)胞的GSIS，并推測(cè)其機(jī)制可能涉及線粒體氧化應(yīng)激損傷。課題組前期研究也證實(shí)了波動(dòng)性高糖對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷作用［6］。

IRS2是維護(hù)胰島β細(xì)胞功能的關(guān)鍵信號(hào)蛋白。Hennige等［11］發(fā)現(xiàn)，小鼠β細(xì)胞內(nèi)IRS2表達(dá)增加可以促進(jìn)β細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和改善其胰島素分泌功能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高糖波動(dòng)狀態(tài)下INS-1細(xì)胞的IRS2蛋白表達(dá)水平顯著降低，這可能是與高糖波動(dòng)狀態(tài)下IRS2的異常降解有關(guān)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，IRS2絲氨酸731位點(diǎn)磷酸化水平卻明顯增高，這可能是由于高糖波動(dòng)狀態(tài)抑制蛋白酪氨酸激酶的活化，而菩人丹干預(yù)后INS-1細(xì)胞的IRS2蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯升高，IRS2絲氨酸731位點(diǎn)磷酸化水平明顯下降，說(shuō)明菩人丹能有效抑制IRS2蛋白降解和IRS2蛋白731位點(diǎn)絲氨酸磷酸化，從而修復(fù)高糖波動(dòng)狀態(tài)下INS-1細(xì)胞的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)障礙。

AKT分子通過(guò)不同的下游底物調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞大小、數(shù)量、細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄以及細(xì)胞分泌功能［12］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在高糖波動(dòng)狀態(tài)下Akt蘇氨酸308位點(diǎn)磷酸化水平明顯降低，進(jìn)而使INS-1細(xì)胞胰島素分泌功能下降。

mTOR是磷脂酰肌醇相關(guān)蛋白激酶(PIKK)的家族成員，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，可以響應(yīng)細(xì)胞外信號(hào)，激活下游效應(yīng)因子，參與基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯等過(guò)程，以調(diào)節(jié)β細(xì)胞生存、增殖及蛋白質(zhì)合成。P70s6k是mTOR的下游靶蛋白，是mTOR效應(yīng)因子中研究最廣泛的，P70s6k的Thr389磷酸化被認(rèn)為是mTOR激活的鏡子［13］。本實(shí)驗(yàn)觀察到，在高糖波動(dòng)狀態(tài)下INS-1細(xì)胞mTOR和P70s6k活性均受到抑制，mTOR(ser2448)和P70s6k(thr389)磷酸化水平均顯著降低。而菩人丹干預(yù)后，mTOR和P70s6k的磷酸化水平均明顯升高，提示菩人丹可通過(guò)促進(jìn) Akt和 mTOR的磷酸化水平進(jìn)而活化P70s6k，使細(xì)胞總體蛋白質(zhì)翻譯水平升高，從而促進(jìn)INS-1細(xì)胞的增殖。

PTP1B可在胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)中的多個(gè)位點(diǎn)發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，過(guò)度表達(dá)PTP1B能增加胰島素受體、胰島素受體底物的脫磷酸化，并下調(diào)受體后信號(hào)，從而引起胰島素信號(hào)傳導(dǎo)障礙并引發(fā)胰島素抵抗甚至T2DM。研究表明［14］，敲除PTP1B基因后，小鼠胰島素敏感性顯著增強(qiáng)，即使在高脂高熱卡飲食環(huán)境下，小鼠也不出現(xiàn)肥胖或胰島素抵抗，若重新表達(dá)PTP1B，原本增強(qiáng)的胰島素敏感性則會(huì)出現(xiàn)顯著減弱。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在高糖波動(dòng)狀態(tài)下，INS-1細(xì)胞PTP1B蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著上調(diào)，而菩人丹干預(yù)后細(xì)胞PTP1B蛋白質(zhì)表達(dá)水平下降，說(shuō)明菩人丹部分抑制PTP1B對(duì)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)性調(diào)控，從而改善INS-1細(xì)胞IRS2/PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)。

前期研究表明，菩人丹具有降糖、調(diào)脂、減輕胰島素抵抗、抑制胰島β細(xì)胞凋亡、保護(hù)胰島β細(xì)胞功能的作用［4-9］。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了菩人丹對(duì)高糖波動(dòng)胰島β細(xì)胞胰島素分泌功能的影響，揭示了菩人丹通過(guò)調(diào)控IRS2/PI3K/Akt信號(hào)通路中IRS2、Akt、mTOR/P70s6k和PTP1B蛋白質(zhì)表達(dá)水平及其磷酸化水平，改善胰島β細(xì)胞分泌功能的分子機(jī)制，為菩人丹修復(fù)胰島β細(xì)胞損傷，防治T2DM的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］HOU，Li HL，ZHAO JJ，et al.Impairment of pancreatic islet beta cell function induced by intermittent high glucose through oxidative and endoplasmic reticulum stress:experiment with rat pancreatic islet beta cells［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2008，88(28):2002-2004.

［2］ SYEDA K，MOHAMMED A M，ARORA D K，et al.Glucotoxic conditions induce endoplasmic reticulum stress to cause caspase 3 mediated lamin B degradation in pancreatic beta-cells:protection by nifedipine［J］.Biochem Pharmacol，2013，86(9):1338-1346.

［3］KIM M，CHUNG H，YOON C，et al.Increase of INS-1 cell apoptosis under glucose fluctuation and the involvement of FOXOSIRT pathway［J］.Diabetes Res Clin Pract，2012，98(1):132-139.

［4］龐宗然，趙玉堂，李靜華，等.菩人丹超微粉對(duì)肥胖型2型糖尿病大鼠糖代謝相關(guān)指標(biāo)的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(5):107-110.

［5］金英，魯碧楠，劉祖涵，等.菩人丹對(duì)T2DM大鼠胰島β細(xì)胞分泌功能及胰島素敏感性的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2012，18(10):1090-1092.

［6］魯碧楠.菩人丹對(duì)糖脂毒導(dǎo)致的INS-1細(xì)胞損傷的修復(fù)作用及機(jī)制研究［D］.北京:中央民族大學(xué)，2013.

［7］杜子亮，魯碧楠，陳書(shū)，等.菩人丹對(duì)高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡、BAD和FOXO1蛋白表達(dá)的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(22):173-177.

［8］ 陳書(shū)，魯碧楠，杜子亮，等.菩人丹調(diào)控IRS2、BAD、FOXO1蛋白表達(dá)和磷酸化抑制INS-1細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2013，19(11):1341-1344.

［9］魯碧楠，蘇占輝，蘇曉慧，等.菩人丹超微粉對(duì)T2DM大血管損傷大鼠骨骼肌IRS-1，GLUT-4，PI-3K，NF-κB蛋白表達(dá)的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(9):210-214.

［10］邱平，趙鐵耘，李秀鈞，等.間斷高濃度葡萄糖對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷機(jī)制研究［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2008，39 (6):69-71，93.

［11］ HENNIGE A M，SARTORIUS T，TSCHRITTER O， et al.Tissue selectivity ofinsulin detemiraction in vivo［J］.Diabetologia，2006，49(6):1274-1282.

［12］MIAO X Y，GU Z Y，LIU P，et al.The human glucagon-like peptide-1 analogue liraglutide regulatespancreatic beta-cell proliferation and apoptosis via an AMPK/mTOR/P70S6K signaling pathway［J］.Peptides，2013，39:71-79.

［13］李小明，楊作成，陳淳媛，等.mTOR/p70S6K信號(hào)通路與NIH3T3成纖維細(xì)胞增殖［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，35 (18):3582-3584.

［14］PANZHINSKIY E，REN J，NAIR S. Protein tyrosine

phosphatase 1B and insulin resistance:role of endoplasmic reticulum stress/reactive oxygen species/nuclear factor kappa B axis［J］.PLoS One，2013，8(10):e77228.

Purendan Improving the Molecular Mechanism of Ins-1 Cell Insulin Secretion under High Glucose Fluctuation

BAI Ying-hui1，DU Zi-liang2，CHEN Shu1，LU Bi-nan1，PANG Zong-ran1Δ
(1.Institute of Chinese Minority Traditional Medicine，Mizu University of China.Key Laboratory for Chinese Minority Traditional Medicine of Ministry of Education，Beijing 100081，China;2.The Moslem Hospital of Bejing，Beijing 100053，China)

Objective:To study the molecular mechanism of Pu Ren Dan improving the secretion function of INS-1 cell under fluctuated high glucose.Methods:INS-1 cell was cultured in high glucose RPMI1640 medium containing 33.3 mmol ·L－1glucose and conventional RPMI1640 medium containing 11.1 mmol·L－1glucose each 12 hours for 5 days to induce fluctuated high glucose cell model.INS-1 cell was intervened in 5%and 10%drug serum containing PRD for 24 hours as PRD experimental group，drug serum containing Metformin as the positive control group.The INS-1 cell in the normal control group was cultured in RPMI1640 medium containing 11.1 mmol·L－1glucose.Using CCK-8 kit to detect cell viability，ELISA to test the insulin secretion of INS-1 cell，Western blot assay to test proteins expression and phosphorylation levels of IRS2，Akt，mTOR，P70s6k，PTP1B.Results:Compared with the control group，cell viability and insulin secretion level of INS-1 cell in FG decreased significantly.Protein expression level of IRS2 decreased，phosphorylation of IRS-2 increased;phosphorylations of Akt，mTOR and P70s6k lowered significantly;while the protein expression level of PTP1B increased.Compared with the model group，cell viability and insulin secretion level of INS-1 cell in PRD experimental group increased significantly.Protein expression level of IRS2 increased，phosphorylation of IRS2 lowered;phosphorylations of Akt，mTOR and P70s6k increased significantly;while the protein expression level of PTP1B decreased.Conclusion:Pu Ren Dan regulates the protein expression and phosphorylation levels of IRS2，Akt，mTOR，P70s6k and PTP1B of INS-1 cell induced by fluctuated high glucose，improving the insulin secretion function of INS-1 cell under fluctuated high glucose.

INS-1 cell;Fluctuated High Glucose;Insulin secretion;Pu Ren Dan;IRS2-PI3K/Akt

R285.5

B

1006-3250(2016)12-1620-05

2016-05-27

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81072963)-菩人丹超微粉調(diào)控PTP1B蛋白與IRS2/PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)改善胰島β細(xì)胞形態(tài)與功能的作用機(jī)制;國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81302946)-基于IR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的菩人丹修管T2DM胰島β細(xì)胞損傷作用靶點(diǎn)研究

白穎慧(1991-)，女，河南新密人，在讀碩士，從事2型糖尿病發(fā)病機(jī)制及其傳統(tǒng)醫(yī)藥干預(yù)研究。

△通訊作者:龐宗然(1966-)，男，研究員，博士研究生導(dǎo)師，從事糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制與中醫(yī)藥干預(yù)研究，Tel: 010-68935090，E-mail:zrpang@163.com。