王永輝，楊瓊，徐輝明，高維強

(1上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院，上海200217;2上海交通大學Med-X臨床干細胞研究中心)

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4種化學小分子聯(lián)合誘導鼠胚胎成纖維細胞轉(zhuǎn)化為施旺細胞效果觀察

王永輝1,2，楊瓊1,2，徐輝明1,2，高維強1,2

(1上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院，上海200217;2上海交通大學Med-X臨床干細胞研究中心)

目的觀察轉(zhuǎn)化生長因子-β抑制劑SB431542、骨形態(tài)發(fā)生蛋白抑制劑Noggin、腺苷酸環(huán)化酶抑制劑FSK、 組蛋白去乙?；敢种苿┒∷徕c聯(lián)合誘導鼠胚胎成纖維細胞(MEF)轉(zhuǎn)化為施旺細胞的效果。方法將孕13.5 d雌鼠處死后取胎鼠分離MEF細胞，分為觀察組和對照組；觀察組置于含10 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、20 ng/mL表皮細胞生長因子、 20 ng/mL膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、 5 μmol/L 全反式維甲酸、10 μmol/L SB431542、200 ng/mL Noggin、10 μmol/L FSK、0.2 mmol/L丁酸鈉的neurobasal培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)，隔天換液，共誘導3周,對照組不處理。在倒置相差顯微鏡下觀察并記錄兩組轉(zhuǎn)化細胞的形態(tài)，采用Q-PCR法檢測兩組施旺細胞標志物S100β、人蛋白脂質(zhì)蛋白抗體(PLP)mRNA。結(jié)果誘導培養(yǎng)3周后可見部分MEF細胞變成梭形，胞體較小，兩側(cè)突起纖長，呈旋渦狀排列。觀察組S100β、PLP mRNA相對表達量分別為34.100±5.657、18.980±2.031，對照組分別為0.985±0.015、0.995±0.005(P均<0.05)。結(jié)論SB431542、Noggin、Forskolin和丁酸鈉聯(lián)合可誘導鼠胚胎MEF轉(zhuǎn)化為施旺細胞。

大鼠；胚胎；成纖維細胞；施旺細胞；轉(zhuǎn)化生長因子-β；骨形態(tài)發(fā)生蛋白；腺苷酸環(huán)化酶；組蛋白去乙?；?/p>

脊髓損傷是脊柱損傷最嚴重的并發(fā)癥，可導致?lián)p傷節(jié)段以下肢體嚴重功能障礙，目前臨床尚無有效治療方法。施旺細胞是周圍神經(jīng)主要的支持細胞，具有神經(jīng)傳導、神經(jīng)保護、神經(jīng)再生及神經(jīng)營養(yǎng)作用[1,2]。最新研究發(fā)現(xiàn)，施旺細胞可促進損傷脊髓神經(jīng)細胞修復(fù)[2～4]，但具有再生困難等缺點。自體細胞直接誘導分化為施旺細胞是目前的研究熱點[5]。S100β和人蛋白脂蛋白抗體(PLP)是施旺細胞的特異表達基因。2014年12月～2015年12月，我們觀察了轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)抑制劑SB431542、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)抑制劑Noggin、腺苷酸環(huán)化酶(cAMP)抑制劑FSK、 組蛋白去乙?；敢种苿┒∷徕c聯(lián)合誘導鼠胚胎成纖維細胞(MEF)轉(zhuǎn)化為施旺細胞的情況，旨在為脊髓損傷的細胞治療提供參考?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1材料孕13.5 d的C57B1/6的雌性大鼠5只，體質(zhì)量25～35 g,購自上海斯萊克公司；兔抗S100β單克隆抗體及兔抗PLP多克隆抗體均購自艾美捷公司，TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及核酸凝膠染料(SBYR Green)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮細胞生長因子(EGF)、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)，全反式維甲酸(RA)、SB431542、Noggin、FSK、丁酸鈉等材料購自R&D system和Sigma公司，其余儀器購自Applied Biosystems公司, 10 % 胎牛血清(FBS)和1%青霉素-鏈霉素(P-S)購自Life technology公司。

1.2MEF細胞的分離將孕13.5 d雌鼠處死后取胎鼠，根據(jù)文獻[6]方法分離MEF，去除胎鼠的脊髓以避免殘留的神經(jīng)干細胞及神經(jīng)元的干擾。用含有10 % FBS和1% P-S的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第2代備用。

1.3細胞誘導培養(yǎng)取適量MEF，當細胞融合至80%～90%時傳代至多聚賴氨酸預(yù)處理的培養(yǎng)皿和圓玻片上，第2天時吸出MEF培養(yǎng)基，PBS沖洗1次，置于含10 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、 20 ng/mL GDNF、 5 μmol/L RA、10 μmol/L SB431542、200 ng/mL Noggin、10 μmmol/mL FSK、0.2 mmol/L丁酸鈉的neurobasal培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2環(huán)境下誘導培養(yǎng)，隔天換液，共誘導3周。

1.4細胞特性鑒定

1.4.1細胞形態(tài)觀察取適量細胞，用PBS洗3次；4%多聚甲醛固定15 min，3%牛血清白蛋白封閉 1 h，再用一抗4 ℃孵育過夜。PBS洗3～5次，然后用相應(yīng)的二抗室溫避光孵育1 h。PBS洗3～5次,DAPI孵育3 min。封片后在倒置相差顯微鏡下觀察，記錄轉(zhuǎn)化細胞的形態(tài)。

1.4.2細胞S100β、PLP mRNA檢測 采用Q-PCR法。取適量誘導3周的MEF細胞(觀察組)、方法1.2中分離的MEF細胞(對照組)，PBS沖洗1次，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成1 μg cDNA，所有操作嚴格按照使用說明書進行。利用ABI PRISM 7900熒光實時定量PCR儀對擴增數(shù)據(jù)進行收集，并利用ABI公司的SDS2.3軟件進行數(shù)據(jù)分析。以GAPDH為內(nèi)參對照，采用ΔCt法計算兩組細胞S100β、PLP mRNA相對表達量，實驗重復(fù)3次。

2　結(jié)果

誘導培養(yǎng)3周后,可見部分MEF細胞變成梭形，胞體較小，兩側(cè)突起纖長，呈旋渦狀排列。觀察組S100β、PLP mRNA相對表達量分別為34.100±5.657、18.980±2.031，對照組分別為0.985±0.015、0.995±0.005，觀察組S100β、PLD mRNA相對表達量均高于對照組，P均<0.05。

3　討論

神經(jīng)細胞再生困難,多能干細胞[包括胚胎干細胞和誘導型多能干細胞(iPS)]分化、體細胞轉(zhuǎn)分化是目前研究熱點。施旺細胞主要分布在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元的突起周圍，細胞形狀不規(guī)則；其是周圍神經(jīng)纖維的鞘細胞，可反復(fù)包裹周圍神經(jīng)纖維的軸突形成髓鞘。研究發(fā)現(xiàn)，施旺細胞外表面有一層基膜，在周圍神經(jīng)再生中起重要作用[7, 8]。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪干細胞[9]、間充質(zhì)干細胞[10]和iPS[11]均可誘導分化為施旺細胞，但分化效率低，且iPS具有高致瘤性[12]。Vierbunchon等[6]通過病毒載體表達轉(zhuǎn)錄因子Ascl1、Brn2和Myt1l成功將MEF轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)細胞，但病毒載體可導致基因組整合，染色體不穩(wěn)定，最終導致細胞癌變。既往研究發(fā)現(xiàn)，化學小分子可將人體細胞直接轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元[16]和神經(jīng)膠質(zhì)細胞[5]。Thoma等[5]使用多種化學小分子成功將成纖維細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)嵴細胞, 然后再進一步分化為施旺細胞。我們前期研究成功將MEF轉(zhuǎn)分化為GABA能神經(jīng)元[12，13]。

在施旺細胞的發(fā)育過程中，TGF-β會導致施旺細胞凋亡[17]。有實驗證明，在神經(jīng)元與施旺細胞共培養(yǎng)的體系中，TGF-β1可抑制樹突與施旺細胞之間的信號傳導，最終抑制施旺細胞增殖，抑制髓鞘的形成[18]。因此，本研究采用TGF-β抑制劑SB431542來抑制施旺細胞凋亡、促進施旺細胞增殖及髓鞘形成。而Noggin可通過抑制BMP，促進神經(jīng)干細胞的增殖[19，20]。cAMP在抑制施旺細胞的增殖和分化成髓鞘細胞的過程中均起重要作用[21]，而FSK可通過抑制其來降低cAMP水平；丁酸鈉是將成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為施旺細胞誘導培養(yǎng)基中非常重要的成分[5]。另外，我們的培養(yǎng)體系中還添加了生長因子RA，原因是RA在神經(jīng)系統(tǒng)形成、神經(jīng)元的特化以及軸突生長過程中均起重要作用[22]。既往研究發(fā)現(xiàn)施旺細胞表面存在RA受體，提示RA在病理情況下和軸突的生長及再生發(fā)揮重要作用。此外，bFGF、GDNF和EGF均可促進神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成[23]。

綜上所述，SB431542、Noggin、FSK和丁酸鈉聯(lián)合可誘導鼠胚胎MEF轉(zhuǎn)化為施旺細胞，但其具體機制尚有待于進一步研究。

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國家自然科學基金資助項目(31571399)。

高維強(E-mail: gao.weiqiang@sjtu.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.010

R329.2

A

1002-266X(2016)18-0032-03