陸光興， 詹曉北*，， 朱 莉， 鄭志永， 吳劍榮， 羅 宸

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院/糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇 無(wú)錫214125）

薄層層析-圖像分析定量熱凝膠β-1，3-葡寡糖

陸光興1， 詹曉北*1，2， 朱 莉2， 鄭志永1， 吳劍榮1， 羅 宸1

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院/糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇 無(wú)錫214125）

單向兩次薄層層析展開(kāi)可以顯著提高對(duì)熱凝膠β-1，3-葡寡糖的分析效果，以Silica gel 60 F254硅膠板為固定相，V（乙酸）∶V（乙酸乙酯）∶V（水）=2∶2.4∶1.4為展開(kāi)劑，展距20 cm時(shí)，單向兩次展開(kāi)可以較好地分離聚合度為2～13的熱凝膠β-1，3-葡寡糖。此外還建立了Image J軟件圖像分析定量熱凝膠β-1，3-葡寡糖的方法，在不同糖質(zhì)量濃度范圍（0.02～0.1、0.1～0.8、0.8～5.0 g/L）內(nèi)寡糖顯色斑點(diǎn)的灰度積分響應(yīng)值與糖濃度分別有著很好的線性關(guān)系（R2＞0.99）。該方法的靈敏度高達(dá)0.02 g/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1%～5%，穩(wěn)定性很好。與HPLC等方法相比具有操作簡(jiǎn)便、分析快速、不需專(zhuān)門(mén)儀器和特定寡糖標(biāo)準(zhǔn)品等優(yōu)點(diǎn)。

熱凝膠；β-1，3-葡寡糖；薄層層析；圖像分析；Image J軟件

熱凝膠 （Curdlan）是一種主要由土壤桿菌（Agrobacterium sp.）發(fā)酵生產(chǎn)的線性β-1，3-葡聚糖[1]，已于1996年獲得FDA批準(zhǔn)作為食品添加劑使用[2]。熱凝膠因其獨(dú)特的理化性能和生理活性廣泛應(yīng)用于食品、化工、農(nóng)業(yè)、煙草和醫(yī)藥工業(yè)中[3]。β-1，3-葡寡糖是一種新型的功能性低聚糖，具有抗腫瘤[4]、增強(qiáng)免疫力[5]、刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子[6]和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性[7]等功能，受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。目前β-1，3-葡寡糖可以由化學(xué)合成法和多糖水解法制備?；瘜W(xué)合成法成本高，難以實(shí)現(xiàn)批量化生產(chǎn)，而利用通過(guò)發(fā)酵獲得的熱凝膠水解獲得β-1，3-葡寡糖具有快速、高效、可批量生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)[8-9]，是目前 β-1，3-葡寡糖制備的主要手段，但生產(chǎn)的β-1，3-葡寡糖是寡糖混合體系，存在快速定性定量分析難，最終影響產(chǎn)品生產(chǎn)質(zhì)量等問(wèn)題。

寡糖的定性定量分析方法主要有薄層層析（TLC）、高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）、毛細(xì)管電泳（CE）等。HPLC、GC、CE雖然可以較好的寡糖進(jìn)行定性定量分析，但存在樣品前處理復(fù)雜、分析耗時(shí)耗力等問(wèn)題[10]。而薄層層析具有簡(jiǎn)便快捷、直觀經(jīng)濟(jì)、靈敏度高、樣品無(wú)需特殊處理的優(yōu)點(diǎn)，可在短時(shí)間內(nèi)分析大量樣品，已經(jīng)作為寡糖的初步檢測(cè)方法得到廣泛應(yīng)用[11]。

TLC分析結(jié)果可以采用TLC掃描法 （TLC-densitometric method）進(jìn)行定量分析，最新研究發(fā)現(xiàn)可以利用 TLC圖像分析法 （TLC-image analysis method）代替掃描法進(jìn)行定量研究，并且兩種方法得到的結(jié)果是一致的，相較而言圖像分析法能夠迅速得到整張TLC板的數(shù)據(jù)[12]。圖像分析應(yīng)用較為廣泛的 軟 件 有 Image-Pro Plus、Image J、TLSee、ColorDens、JustTLC、Scion等。國(guó)外對(duì)TLC圖像分析有了比較多的研究，國(guó)內(nèi)研究還比較少。Mustoe等[13]利用Epson GT-9600平板式掃描儀掃描TLC板獲得圖像后利用Image-Pro Plus V4.0軟件進(jìn)行分析，同時(shí)直接利用TLC掃描儀進(jìn)行分析，比較發(fā)現(xiàn)兩種分析方式分析熒光染料含量的結(jié)果非常接近。Gerasimov[14]TLC展開(kāi)食品染料，再利用ColorDens軟件分析平板式掃描儀掃描得到的圖像，實(shí)現(xiàn)了對(duì)食品染料的定量分析。

作者使用不同展開(kāi)劑體系對(duì)熱凝膠水解制備β-1，3-葡寡糖進(jìn)行單向兩次薄層層析展開(kāi)，優(yōu)化分析β-1，3-葡寡糖的展開(kāi)劑。建立Image J軟件灰度積分快速定量β-1，3-葡寡糖的方法，為β-1，3-葡寡糖的優(yōu)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供一種簡(jiǎn)便的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熱凝膠：食品級(jí)，日本武田-麒麟公司產(chǎn)品；麥芽糊精（DE 8～10、DE 9～13、DE 15～20）：山東西王集團(tuán)產(chǎn)品；高效硅膠薄層層析鋁箔板：Silica gel 60 F254，德國(guó)Merck公司產(chǎn)品。

二甲亞砜（DMSO）、鹽酸、甲醇、乙醇、異丙醇、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、苯、丙酮、乙酰丙酮、乙醚、石油醚、丙醛、乙酸乙酯、葡萄糖、麥芽糖、β-環(huán)糊精、糊精（玉米）等試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

AL204型分析天平：梅特勒-托利多儀器公司產(chǎn)品；XW-80A型旋渦混合器：上海精科實(shí)業(yè)公司產(chǎn)品；離心機(jī)：Sigma-Aldrich Inc產(chǎn)品；Epson Perfection 2480 Photo掃描儀：Seiko Epson Inc產(chǎn)品；島津高效液相色譜儀LC-2010A（配示差檢測(cè)器）：日本島津公司產(chǎn)品等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 熱凝膠β-1，3-葡寡糖的制備 量取50 mL二甲亞砜于100 mL小燒杯中置于80℃的大功率磁力攪拌器上，邊磁力攪拌、邊沿?zé)吘壴?0 s內(nèi)加入500 mg熱凝膠粉末，繼續(xù)攪拌直至形成均一透亮的熱凝膠溶液（10 g/L）。取50 mL離心管分裝熱凝膠溶液后加入濃鹽酸至終濃度0.5 mol/L，封蓋后置于80℃水浴鍋中水解90 min。

1.3.2 有機(jī)溶劑沉淀熱凝膠β-1，3-葡寡糖 水解結(jié)束后加入1～10倍體積的有機(jī)溶劑，高速漩渦震蕩并觀察是否有沉淀析出，10 000 r/min離心 10min，將得到的沉淀用有機(jī)溶劑洗滌3次后烘干，去離子水復(fù)溶后進(jìn)行TLC分析。

1.3.3 一次TLC展開(kāi)分析 取1.5μL待測(cè)樣品點(diǎn)到Silica gel 60 F254薄層層析板上，展距10 cm，展開(kāi)劑為V（乙酸）∶V（乙酸乙酯）∶V（水）=2∶2∶0.8。室溫展開(kāi)完畢后晾干后噴硫酸-乙醇-地衣酚顯色劑，105℃烘箱烘烤5 min顯色[15]。

1.3.4 兩次TLC展開(kāi)分析 實(shí)驗(yàn)方法同1.3.3，展距20 cm，兩次展開(kāi)的展開(kāi)劑選擇V（乙酸）∶V（乙酸乙酯）∶V（水）=2∶2∶1.1或2∶2∶1.2或2∶2∶1.3或2∶2∶1.4或2∶2.2∶1.4或2∶2.4∶1.4或2∶2.6∶1.4或2∶2.8∶1.4，一次展開(kāi)后將TLC板置于鼓風(fēng)干燥箱75℃烘干5 min，再次置于展開(kāi)缸中展開(kāi)分析。

1.3.5 Image J灰度積分定量分析 用Epson掃描儀掃描顯色后TLC硅膠板，掃描設(shè)定為24位彩色、400 dpi，再利用Image J對(duì)掃描得到的圖片進(jìn)行圖像分析，先將圖像轉(zhuǎn)換為8位灰度，消除背景、噪音等因素后進(jìn)行灰度積分分析。

1.3.6 HPLC分析 流動(dòng)相為V（乙腈）∶V（水）=70∶30，進(jìn)樣量100 μL，流量1.50 mL/min，柱溫30℃[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)溶劑沉淀熱凝膠β-1，3-葡寡糖

研究發(fā)現(xiàn)可以使用丙酮沉淀DMSO中的熱凝膠β-1，3-葡寡糖[17]。作者篩選甲醇、乙醇、異丙醇、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、苯、丙酮、乙酰丙酮、乙醚、石油醚、丙醛、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探索沉淀熱凝膠β-1，3-葡寡糖的最佳有機(jī)溶劑。

二氯甲烷、氯仿、丙酮、苯、乙酰丙酮和乙酸乙酯可以沉淀β-1，3-葡寡糖，其中效率最高的是氯仿，其次是苯、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮和乙酰丙酮?？紤]到沉淀效果、回收難易、使用安全性和環(huán)保等要求，二氯甲烷和乙酸乙酯是較佳的沉淀有機(jī)溶劑。10倍體積乙酸乙酯可以幾乎將除微量單糖外的所有β-1，3-葡寡糖沉淀下來(lái)，因此分析時(shí)可以用10倍體積的乙酸乙酯沉淀熱凝膠β-1，3-葡寡糖，既能終止水解反應(yīng)又能避免高濃度離子對(duì)TLC分析造成的拖尾影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 一次TLC展開(kāi)分析熱凝膠β-1，3-葡寡糖

目前寡糖TLC分析多為一次展開(kāi)，由于較高聚合度（DP）寡糖的比移率（Rf）接近、分離度（Rs）較差，嚴(yán)重影響了TLC分析寡糖完整性和準(zhǔn)確度。如圖2所示使用展開(kāi)劑V（乙酸）∶V（乙酸乙酯）∶V（水）=2∶2∶0.8僅能分離到五糖。盡管研究表明本展開(kāi)劑可以展開(kāi)到十糖，但是由于較高DP寡糖的比移率非常接近、分離度很低造成定性定量分析的困難。此外使用展開(kāi)劑V（正丙醇）∶V（水）=7∶3和V（乙醇）∶V（正丁醇）∶V（水）=5∶5∶4展開(kāi)時(shí)，寡糖重疊嚴(yán)重，都不如V（乙酸）∶V（乙酸乙酯）∶V（水）=2∶2∶0.8的展開(kāi)效果好。

2.3 兩次TLC展開(kāi)分析熱凝膠β-1，3-葡寡糖

一般可以通過(guò)使用更長(zhǎng)的TLC板、多次展開(kāi)和優(yōu)化展開(kāi)劑[18]等方法提高TLC的分析效果，其中展開(kāi)劑是決定分離效果的關(guān)鍵因素。楊雅麟等[19]以硅膠板GF 254為固定相，經(jīng)過(guò)展開(kāi)劑優(yōu)化后兩次展開(kāi)最高可分析蔗糖到蔗果十糖之間的低聚糖。作者以原展開(kāi)劑V（乙酸）∶V（乙酸乙酯）∶V（水）=2∶2∶0.8為基礎(chǔ)，使用20 cm的硅膠板進(jìn)行展開(kāi)，調(diào)節(jié)展開(kāi)劑不同組分的相對(duì)比例對(duì)熱凝膠β-1，3-葡寡糖展開(kāi)劑系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化。

2.3.1 展開(kāi)劑水的相對(duì)比例對(duì)熱凝膠β-1，3-葡寡糖展開(kāi)效果的影響 熱凝膠β-1，3-葡寡糖極性很大，極易溶于水，提高展開(kāi)劑水的比例會(huì)降低容量因子，從而提高寡糖的比移率和對(duì)寡糖的展開(kāi)能力。隨著展開(kāi)劑含水比例的上升，寡糖展開(kāi)能力逐漸上升，但是寡糖的分離度逐漸下降，4種展開(kāi)劑可分析的最高聚合度寡糖依次為九糖、十糖、十一糖、九糖。以V（乙酸）∶V（乙酸乙酯）∶V（水）=2∶2∶1.4為基礎(chǔ)提高乙酸乙酯的比例，在保證較高展開(kāi)能力的基礎(chǔ)上提高分離度。

2.3.2 展開(kāi)劑乙酸乙酯的相對(duì)比例對(duì)熱凝膠β-1，3-葡寡糖展開(kāi)效果的影響 乙酸乙酯極性較弱，提高展開(kāi)劑中乙酸乙酯的相對(duì)比例會(huì)降低寡糖的展開(kāi)能力但會(huì)提高寡糖分析的分離度，從而對(duì)可分析寡糖的聚合度范圍產(chǎn)生影響。根據(jù)TLC結(jié)果可以判斷展開(kāi)劑V（乙酸）∶V（乙酸乙酯）∶V（水）=2∶2.4∶1.4為較優(yōu)展開(kāi)劑，可以較好的分離DP 2～13的寡糖，且寡糖的分離度較高。

2.3.3 兩種展開(kāi)劑對(duì)熱凝膠β-1，3-葡寡糖展開(kāi)效果的影響 展開(kāi)能力和分離度是寡糖TLC分析的兩個(gè)主要指標(biāo)，但在展開(kāi)劑的優(yōu)化篩選時(shí)兩者相互矛盾，提高展開(kāi)劑中水的比例可以提高展開(kāi)能力但會(huì)降低分離度，提高展開(kāi)劑中乙酸乙酯的比例可以提高分離度但會(huì)降低展開(kāi)能力。使用兩種組分比例不同的展開(kāi)劑可以起到協(xié)同互補(bǔ)的作用，4種展開(kāi)劑系統(tǒng)下可分析的最大聚合度寡糖的依次為十糖、十二糖、十一糖、十糖，且分離度都較高。

2.4 Image J灰度積分分析熱凝膠β-1，3-葡寡糖

使用Epson Perfection 2480 Photo掃描儀獲取TLC掃描圖像后，探索使用Image J圖像分析軟件灰度積分對(duì)熱凝膠β-1，3-葡寡糖進(jìn)行定量分析。

2.4.1 檢出限和定量限 選取8種單糖、二糖和寡糖混合物為標(biāo)準(zhǔn)品，分別為葡萄糖、麥芽糖、β-環(huán)糊精、麥芽糊精（DE 8～10）、麥芽糊精（DE 9～13）、麥芽糊精（DE 15～20）、糊精（玉米）和熱凝膠β-1，3-葡寡糖。分別用去離子水配制為0.01 g/L～0.2 g/L糖溶液，點(diǎn)樣顯色后進(jìn)行掃描和灰度積分分析。結(jié)果顯示糖濃度高于0.02 g/L時(shí)都可以很好的檢測(cè)出來(lái)，且在0.02 g/L～0.1 g/L糖濃度范圍內(nèi)也顯示了較好的線性（R2＞0.99），結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.4.2 線性關(guān)系和范圍 選取上述8種糖為標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水配制質(zhì)量濃度為0.01～5.0 g/L的糖溶液，點(diǎn)樣顯色后進(jìn)行掃描和灰度積分分析。盡管糖的種類(lèi)、聚合度和構(gòu)像不同，但是每種糖的灰度積分響應(yīng)值和糖濃度具有很好的線性關(guān)系。在0.02～0.1 g/L、0.1～0.8 g/L和0.8～5.0 g/L糖質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，灰度積分的響應(yīng)值和糖濃度分別有很好的線性關(guān)系（R2＞0.99），顯示該方法具有較高的準(zhǔn)確性和可信度，但線性斜率逐漸減小。而在0.02～5.0 g/L糖質(zhì)量濃度范圍內(nèi)進(jìn)行綜合分析可知冪函數(shù)可以進(jìn)行較好的擬合定量（R2＞0.99），這種非線性的結(jié)果可以通過(guò)Kubelka-Munk公式解釋?zhuān)⑴c用雙波長(zhǎng)飛點(diǎn)掃描儀的掃描結(jié)果類(lèi)似[20]。

分析認(rèn)為由于采用硫酸-乙醇-地衣酚顯色劑，顯色結(jié)果只和寡糖的單糖組成和質(zhì)量濃度有關(guān)，而與寡糖的結(jié)構(gòu)和聚合度無(wú)關(guān)，表現(xiàn)為8種單糖組成相同但結(jié)構(gòu)和聚合度不同的糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線的高度一致性，這也顯示了TLC-Image J灰度積分在定量同聚寡糖時(shí)只需用其組成單糖作為標(biāo)品而不需要特定的寡糖標(biāo)樣的優(yōu)點(diǎn)。Robyt[21]單向4次薄層層析展開(kāi)麥芽寡糖和異麥芽寡糖，發(fā)現(xiàn)展開(kāi)次數(shù)并不影響糖的光密度響應(yīng)值，且葡萄糖、麥芽寡糖和異麥芽寡糖的TLC光密度響應(yīng)值與糖的結(jié)構(gòu)和聚合度無(wú)關(guān)，可以用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)三類(lèi)糖進(jìn)行定量分析。

2.4.3 精密度 選取10.0 g/L熱凝膠β-1，3-葡寡糖和麥芽糊精（DE 8～10）、麥芽糊精（DE 9～13）麥芽糊精（DE 15～20）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，單向兩次展開(kāi)后進(jìn)行Image J灰度積分分析，重復(fù)6次。結(jié)果顯示熱凝膠β-1，3-葡寡糖和不同DE值的麥芽糊精中的每種聚合度寡糖都有極高的重復(fù)性，分析每種聚合度寡糖的RSD在1%～5%之間，顯示了較好的重復(fù)性，結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.4.4 穩(wěn)定性 選取10.0 g/L熱凝膠β-1，3-葡寡糖和麥芽糊精（DE 8～10）、麥芽糊精（DE 9～13）麥芽糊精（DE 15～20）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，兩次TLC展開(kāi)后分別在0、1、2、4、8、10 h掃描并進(jìn)行Image J灰度積分分析。在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)同一個(gè)樣品進(jìn)行分析的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基本保持一致，RSD大部在1%～5%之間，說(shuō)明該方法有著很好的穩(wěn)定性。但是實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)硫酸-乙醇-地衣酚對(duì)糖的顯色結(jié)果不易長(zhǎng)時(shí)間保存，最好在12 h內(nèi)進(jìn)行圖像掃描保存，否則會(huì)導(dǎo)致分析誤差增大。

2.4.5 與HPLC比較 選取10.0 g/L的熱凝膠β-1，3-葡寡糖進(jìn)行進(jìn)行HPLC和兩次TLC展開(kāi)分析，結(jié)果如表2。對(duì)兩種測(cè)定方法得到的結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)并無(wú)明顯差別，進(jìn)一步證明了Image J灰度積分定量熱凝膠葡寡糖的是一種準(zhǔn)確可靠的方法。Sakunpak等[22]利用TLC掃描定量法和圖像分析法分析冷壓米糠油中的γ-谷維素含量時(shí)發(fā)現(xiàn)兩種方法檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異。Fazakas等[23]采用4種圖像分析軟件 （Sorbfil TLC、Biodit、JustTLC和Melanie）分析熒光化合物TLC圖像發(fā)現(xiàn)4種軟件都可以對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定量，且Biodit的定量最為準(zhǔn)確，誤差為5%左右。

3 結(jié)語(yǔ)

10倍體積的乙酸乙酯可以將除微量葡萄糖以外的DMSO中的熱凝膠水解產(chǎn)物沉淀下來(lái)，既能終止水解反應(yīng)又能避免高濃度離子對(duì)TLC分析造成的拖尾影響。單向兩次TLC展開(kāi)可以很好的分析熱凝膠β-1，3-葡寡糖，分析熱凝膠β-1，3-葡寡糖的最優(yōu)展開(kāi)劑為V（乙酸）∶V（乙酸乙酯）∶V（水）=2∶2.4∶1.4，兩次展開(kāi)后可以最高分離到十三糖，同時(shí)具有較好的分離度。Image J軟件圖像分析定量熱凝膠β-1，3-葡寡糖方便準(zhǔn)確，不需要特殊設(shè)備。由于硫酸-乙醇-地衣酚顯色劑對(duì)寡糖的顯色結(jié)果只與單糖組成和濃度有關(guān)，而與構(gòu)像和聚合度無(wú)關(guān)，因此該定量方法可以廣泛適用于同聚寡糖的濃度分析，而無(wú)需購(gòu)買(mǎi)特定的寡糖標(biāo)準(zhǔn)品，具有簡(jiǎn)便快速，無(wú)需特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。

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Quantification of Curdlan β-1，3-Glucooligosaccharides by Thin Layer Chromatography and Image Analysis

LU Guangxing1， ZHAN Xiaobei*1，2， ZHU Li2， ZHENG Zhiyong1， WU Jianrong1， LUO Chen1
（1.School of Biotechnology/Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Jiangsu Rayguang Biotech Co.Ltd.，Wuxi 214125，China）

The study first found that a unidirectional-twice thin layer chromatography significantly improved the analysis of Curdlan β-1，3-glucooligosaccharides.With the best developing reagents acetic acid，ethyl acetate and H2O in the ratio of 2∶2.4∶1.4 on the Silica gel 60 F254 plate of 20 cm，Curdlan β-1，3-glucooligosaccharides could be separated from the degree of polymerization 2 to 13. Then，the Image J software was used to quantify Curdlan β-1，3-glucooligosaccharides.A good linear relationship（R2＞0.99）existed between saccharides concentration within three ranges of 0.02 g/L～0.1 g/L，0.1 g/L～0.8 g/L and 0.8 g/L～5.0 g/L and grayscale integration respond.The established quantification had a detection limit of 0.02 g/L and a relative standard deviation of 1%～5%with good stability.Compared with other methods such as HPLC，this method is simple and rapid with nospecialized instruments and oligosaccharides standards.

Curdlan，β-1，3-glucooligosaccharide，thin layer chromatography，image analysis，Image J software

TQ 281

A

1673—1689（2016）11—1156—07

2015-02-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171640，31201384，31271888）；無(wú)錫市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（CLE01N1208）；無(wú)錫市生物農(nóng)業(yè)領(lǐng)軍型創(chuàng)業(yè)人才計(jì)劃項(xiàng)目（“130”計(jì)劃）；無(wú)錫中小企業(yè)創(chuàng)新基金項(xiàng)目（CBE01G1344）。

*通信作者：詹曉北（1962—），男，北京人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事生物化工與生物反應(yīng)器研究。

E-mail：xbzhan@yahoo.com