陳闖，姚駿，王麒琳，張弘（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

抗凍蛋白的研究現(xiàn)狀及其應(yīng)用

陳闖，姚駿，王麒琳，張弘
（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

從抗凍蛋白的來(lái)源、研究歷程進(jìn)行闡述，并對(duì)抗凍蛋白的作用機(jī)理、應(yīng)用領(lǐng)域進(jìn)行綜述，以期為抗凍蛋白的工業(yè)化開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

抗凍蛋白；原理；應(yīng)用

抗凍蛋白（AFPs）是一類具有提高生物抗凍能力的蛋白質(zhì)類化合物的總稱。自二十世紀(jì)發(fā)現(xiàn)以來(lái)，研究范圍先后從魚類，昆蟲，轉(zhuǎn)移到植物材料上來(lái)[1]。

抗凍蛋白吸附在冰晶表面，通過(guò)EAFC3效應(yīng)抑制其生長(zhǎng)。機(jī)制的模型為：一般晶體的生長(zhǎng)垂直于晶體的表面，假如雜質(zhì)分子吸附于冰生長(zhǎng)通途的表面，那么需要在外加一推動(dòng)力（冰點(diǎn)下降），促使冰在雜質(zhì)間生長(zhǎng)。由于曲率增大，使邊緣的表面積也增加。因表面張力的影響，增加表面積將使體系的平衡狀態(tài)發(fā)生改變，從而冰點(diǎn)降低[2]。本文從抗凍蛋白的研究歷程、抗凍原理及其應(yīng)用作一綜述，為抗凍蛋白的工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1　抗凍蛋白的來(lái)源及研究歷程

1.1來(lái)源

從20世紀(jì)70年代科學(xué)家首次從極地魚體的血液中提取出抗凍蛋白以來(lái)，經(jīng)過(guò)幾十年的研究發(fā)展，人們相繼從動(dòng)物、植物、微生物中都發(fā)現(xiàn)了具有同樣功能的蛋白質(zhì)。它們都具有一定的抗凍活性，但在組成和結(jié)構(gòu)上卻各不相同，在基因序列上也沒(méi)有同源性，因而造就抗凍蛋白的多樣性和復(fù)雜性[3]。

從微生物中分離提純抗凍蛋白的研究相對(duì)較少。目前已知的從大腸桿菌中分理出的抗凍蛋白分子量大約為7.4 Ku[4]，含大量的親水基團(tuán)；從莫拉氏菌株中分離出的抗凍蛋白是是第一次有報(bào)道的抗凍脂蛋白；另外，有研究者還在北美地區(qū)的一種根瘤菌中發(fā)現(xiàn)了一種抗凍蛋白。真菌中抗凍蛋白的研究相對(duì)來(lái)說(shuō)非常少，有報(bào)道稱在香菇和牡蠣菇中存在著抗凍蛋白[5]。

相對(duì)于魚類、微生物，植物中抗凍蛋白的研究相對(duì)較晚一些，但是植物性抗凍蛋白在應(yīng)用中更容易為人們所接受。植源性的抗凍蛋白原料主要分布于南北回歸線以外高緯度地區(qū)以及高山高寒高海拔的地區(qū)，常見(jiàn)的有高山雪蓮、黑麥草、內(nèi)蒙古生沙冬青等，這些原料存在成本過(guò)高或穩(wěn)定性差等不足。

近年來(lái)相繼在昆蟲、植物（如冬黑麥、沙冬青、唐古特紅景天葉等）體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有類似功能的抗凍蛋白。至今魚類的AFP基因的轉(zhuǎn)化植物已獲成功；與植物中類似AFP基因在微生物體內(nèi)克隆也獲得成功。推測(cè)植物抗凍分子生物學(xué)和培植農(nóng)業(yè)上抗凍新品種的前景必定是光明的。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)5種，包括抗凍糖蛋白、抗凍蛋白Ⅰ、抗凍蛋白Ⅱ、抗凍蛋白Ⅲ、抗凍蛋白Ⅳ[6]。

1.2研究歷程

20世紀(jì)50年代加拿大科學(xué)家Scholander第一次在北極魚體中發(fā)現(xiàn)抗凍物質(zhì)的存在。20世紀(jì)60年代末，生物學(xué)家Arthur DeVries從南極魚類體內(nèi)首次分離抗凍蛋白。1977年Raymond和DeVries提出關(guān)于抗凍蛋白抗凍機(jī)制著名的吸附抑制模型。1992年Griffith等在冬黑麥（winterrye）的葉子中發(fā)現(xiàn)了AFP[7]。2002年Bindslev等研究了抗凍蛋白的過(guò)敏性，斷定AFP不會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)，是一種安全的食品添加劑，可以放心使用。2004年，Unilever將分離自魚類并且在酵母中大規(guī)模復(fù)制的APF應(yīng)用于Breyers品牌的輕雙攪雪糕中，取得良好的效果，并獲得FDA認(rèn)可。2006年我國(guó)首次在食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》上公布抗凍蛋白可以以新的食品添加劑添加到冷凍食品中。

2　抗凍蛋白的作用學(xué)說(shuō)[8]

2.1吸附抑制學(xué)說(shuō)

吸附抑制學(xué)說(shuō)最早在1977年由Raymond和Devries提出，認(rèn)為抗凍蛋白吸附在冰晶表面通過(guò)Kelin效應(yīng)抑制其生長(zhǎng)。吸附抑制學(xué)說(shuō)認(rèn)為大多時(shí)候抗凍蛋白濃度越高抗凍效果越好，抗凍蛋白的抑制重結(jié)晶作用對(duì)保護(hù)大體積細(xì)胞有利，但其實(shí)抗凍蛋白對(duì)小體積細(xì)胞也能起到保護(hù)作用。但此學(xué)說(shuō)忽略了抗凍蛋白與細(xì)胞膜相互作用、抗凍蛋白之間、抗凍蛋白和冰晶復(fù)合體之間的團(tuán)聚作用等。

2.2“偶極子—偶極子”學(xué)說(shuō)

該假說(shuō)在1988年由Yang等提出，認(rèn)為AFPs具有顯著平行于其螺旋軸親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)的偶極子。

2.3氫原子結(jié)合模型

AFP分子一側(cè)是相對(duì)疏水，另一側(cè)是相對(duì)親水，二維陣列顯示是親水一側(cè)與冰相結(jié)合，而疏水一側(cè)與水相作用。氫原子結(jié)合模型認(rèn)為AFPs結(jié)構(gòu)中的氫原子與冰晶上的氧原子匹配并結(jié)合，具有很高的冰結(jié)合專一性，而其自身的氨基酸組成和螺旋結(jié)構(gòu)有利于提高結(jié)合的穩(wěn)定性。

2.4剛體能量學(xué)說(shuō)

把AFP視為小粒子，根據(jù)表面能最小原理以及“AFP—冰”與“AFP—水”界面之間的表面能差異，AFP能強(qiáng)烈吸附在冰晶表面上。即使分子與冰水無(wú)優(yōu)先結(jié)合，當(dāng)抗凍分子存在時(shí)，由于冰-水表面積縮減，AFP也能強(qiáng)烈吸附冰晶。另外，AFP必須與冰晶相匹配，否則就會(huì)使水分子擴(kuò)散至界面，隨著冰晶的增長(zhǎng)同時(shí)使蛋白向前推進(jìn)。水分子在粒子后擴(kuò)散，推進(jìn)粒子向前，在溶液中形成冰晶體。通過(guò)這種方式，即使超過(guò)過(guò)冷卻溫度1℃或更小，也會(huì)產(chǎn)生很大的壓力。

2.5冰核抑制學(xué)說(shuō)

冰核是形成冰晶的基礎(chǔ)，沒(méi)有冰核的存在，冰晶就不可能生長(zhǎng)。冰核抑制學(xué)說(shuō)是近年來(lái)對(duì)抗凍蛋白作用機(jī)制的一種新的見(jiàn)解和補(bǔ)充。2003年Ning Du等通過(guò)試驗(yàn)具體闡述了這種作用機(jī)制，首次發(fā)現(xiàn)抗凍蛋白可以通過(guò)吸附在灰塵和冰核的表面，減少它們之間的聯(lián)合來(lái)抑制新的冰核形成。

3　抗凍蛋白的應(yīng)用

冷食業(yè)在食品工業(yè)中所占的份額越來(lái)越大，低溫冷鏈中眾多食品發(fā)生結(jié)晶和重結(jié)晶現(xiàn)象對(duì)細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞作用，造成細(xì)胞內(nèi)汁液流失。水的結(jié)晶導(dǎo)致溶液局部濃縮現(xiàn)象又促使細(xì)胞內(nèi)組分的性質(zhì)發(fā)生改變，發(fā)生蛋白質(zhì)變性、淀粉回生等現(xiàn)象，這些現(xiàn)象最終使產(chǎn)品品質(zhì)受到嚴(yán)重破壞。作為一類新型的食品添加劑，抗凍蛋白可以有效減少冷凍貯藏的食品中冰晶的形成和重結(jié)晶，從而提高低溫冷鏈系列食品的質(zhì)量。

3.1在食品領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1.1在冷凍乳制品中的應(yīng)用

評(píng)價(jià)冰淇淋質(zhì)量高低的一個(gè)重要的指標(biāo)是其中的冰晶體越細(xì)小越好。如果在冷藏、運(yùn)輸、銷售任何一個(gè)冷鏈環(huán)節(jié)出現(xiàn)較高的溫度就會(huì)發(fā)生重結(jié)晶現(xiàn)象，生成較大的晶體，從而影響冰淇淋的口感．添加抗凍蛋白可以有效防止冷凍貯藏的食品中冰晶的形成。Wang等將冰淇淋經(jīng)過(guò)cold-heat-stage處理后，用顯微鏡觀察冰晶生長(zhǎng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加有抗凍蛋白的冰淇淋樣品冰晶細(xì)小且均勻，而未加抗凍蛋白的冰淇淋樣品冰晶大且不均勻。

3.1.2在冷卻/冷凍肉中的應(yīng)用

肉制品的冷凍、冷藏中，加入AFPs可以有效減少滲水和抑制冰晶的形成，保持原來(lái)的組織結(jié)構(gòu)，減少營(yíng)養(yǎng)流失．據(jù)報(bào)道，將AFPG于屠宰前注入羔羊體內(nèi)，宰后肉體經(jīng)真空包裝，在-20℃凍藏2周～16周，然后解凍，觀察肉的冷凍質(zhì)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在屠宰前1 h 或24 h注射AFPG，都可有效降低冰晶體的體積和液滴的數(shù)量。AFPG注射濃度達(dá)到0.01 mg/kg時(shí)，特別是在宰前24 h注射，可以獲得最小的冰晶體。

抗凍蛋白也可進(jìn)行人工合成，因其具有潛在的商業(yè)價(jià)值，美國(guó)已通過(guò)遺傳路線開(kāi)發(fā)出了這種產(chǎn)品。在食品中的應(yīng)用還包括保護(hù)柑桔果實(shí)免受冷凍損傷，保護(hù)烘焙品（特別是面包烘焙用酵母，需經(jīng)歷冷凍—解凍循環(huán)和貯存）及啤酒酵母等，抗凍蛋白在冷凍食品領(lǐng)域的應(yīng)用被認(rèn)為幾乎是無(wú)限的。

3.1.3在冷凍面團(tuán)技術(shù)中的應(yīng)用

冷凍面團(tuán)技術(shù)是一種烘焙食品加工新技術(shù)，一方面由工廠進(jìn)行面團(tuán)攪拌、切塊、成型、冷凍，另一方面由烘焙房、超市、快餐店在需要時(shí)進(jìn)行解凍、醒發(fā)和烤制。然而，冷凍面團(tuán)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間凍藏，面團(tuán)的品質(zhì)會(huì)下降，如醒發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)，面包比容減小等。Zhang等研究了抗凍蛋白對(duì)冷凍面團(tuán)質(zhì)地特性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加抗凍蛋白的試驗(yàn)組冷凍面團(tuán)的硬度比對(duì)照組更加柔軟和穩(wěn)定，這主要是因?yàn)檩^低的結(jié)冰水含量。食品在低溫貯藏、運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中，抗凍蛋白能有效地抑制冰晶的形成和重結(jié)晶化，而使食品保持質(zhì)地的柔軟性，并能減少滴液防止?fàn)I養(yǎng)成分的損失。目前，由于抗凍蛋白的售價(jià)很高，僅適宜于研究和專門的應(yīng)用，因此，如何不斷地降低抗凍蛋白的成本，是實(shí)現(xiàn)其在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。

3.2在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用

抗凍蛋白對(duì)防止農(nóng)作物被低溫破壞有明顯的效果，通過(guò)抗凍蛋白的轉(zhuǎn)基因作物的種植，可以改進(jìn)農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，延長(zhǎng)作物的生長(zhǎng)季節(jié)和栽種范圍，同時(shí)也會(huì)改善作物在收獲后的儲(chǔ)藏加工特性。

3.3在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

AFP可用于人和動(dòng)物的卵、精子、胚胎或肝臟等器官的超低溫保存，改善其冷凍質(zhì)量。王君暉和黃純農(nóng)對(duì)抗凍蛋白在細(xì)胞的低溫和超低溫保存中的作用進(jìn)行了研究，得出一些有益的結(jié)論：在某些情況下，抗凍蛋白可能不利于某些樣品的低溫和超低溫保存，其中機(jī)制尚需繼續(xù)探討。

3.4在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用

AFP在工業(yè)上可作為一種高級(jí)防凍劑而得已應(yīng)用，例如AFP溶液可以用于高速公路的防凍養(yǎng)護(hù)等。

綜上所述，抗凍蛋白具有極其廣闊的應(yīng)用前景，今后應(yīng)加強(qiáng)抗凍蛋白的應(yīng)用研究，應(yīng)以抗凍蛋白的化學(xué)合成和基因工程為突破口，實(shí)現(xiàn)抗凍蛋白的規(guī)模化生產(chǎn)，將抗凍蛋白應(yīng)用到各個(gè)領(lǐng)域中去。

[1]張暉.抗凍蛋白在食品中應(yīng)用研究進(jìn)展及安全性分析[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2012,31(5):455-457

[2]汪少蕓,李曉坤,周焱富,等.抗凍蛋白的作用機(jī)制及基因工程研究進(jìn)展[J].北京工商大學(xué)學(xué)報(bào),2012,30(2):58-63

[3]黃福貞,韓花翠,曾曉林.植物抗凍蛋白及其應(yīng)用[J].生物學(xué)教學(xué), 2000,25(12):35-36

[4]張黨權(quán),劉兵,范云,等.胡蘿卜抗凍蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003,42(3):53-56

[5]樊紹剛,張黨權(quán),鄧順陽(yáng),等.抗凍蛋白和冰核蛋白對(duì)植物抗凍性能的作用機(jī)制[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2009,27(2):125-130

[6]李芳,王博,艾秀蓮.抗凍蛋白研究進(jìn)展[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2003,40 (6):349-352

[7]彭筱娜,易自力,蔣建雄.植物抗寒性研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào), 2000(4):15-18

[8] 彭淑紅,姚鵬程,徐寧迎.抗凍蛋白的特性和作用機(jī)制[J].2003,34 (3):238-240

The Research Status and Applications of Antifreeze Proteins

CHEN Chuang，YAO Jun，WANG Qi-lin，ZHANG Hong
（Tianjin Food Research Institute Co.，Ltd.，Tianjin 301609，China）

From the source of the antifreeze proteins，elaborates the research process，and the mechanism of antifreeze proteins，the applications were reviewed，in order to provide references for the developmentofindustrialization and application ofantifreeze proteins.

antifreeze proteins；the principle；application

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.046

天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（14ZCZDTC00021）

陳闖（1988—），男（漢），助理工程師，本科，研究方向：化學(xué)工程與工藝。

2016-05-04