郭 錳， 魏艷霞， 任佳偉， 萬里新*

（1.南陽市中心醫(yī)院河南473009；2.華北電力大學醫(yī)院北京102206）

?

青蒿素聯(lián)合順鉑對胃癌細胞增殖、凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

郭 錳1， 魏艷霞1， 任佳偉2， 萬里新1*

（1.南陽市中心醫(yī)院河南473009；2.華北電力大學醫(yī)院北京102206）

摘要:目的 探討青蒿素聯(lián)合順鉑對胃癌SGC-7901細胞增殖、凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響。方法 采用青蒿素（50 μmo1/L）、順鉑（10 mg/L）單藥或聯(lián)合處理SGC-7901細胞，根據(jù)實驗設(shè)計將SGC-7901細胞分為4組:對照組、青蒿素組、順鉑組和青蒿素+順鉑組，對照組僅加入培養(yǎng)基；采用噻唑藍（MTT）比色法檢測各組SGC-7901細胞經(jīng)處理24、48、72、96 h的增殖情況并計算增殖抑制率，采用Annexin V/PI雙染流式細胞術(shù)檢測各組處理24、48 h的凋亡率，免疫印跡法檢測各組處理48 h后的EMT相關(guān)標記分子（E-cadherin、N-cadherin及Vimentin），采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測各組處理24、48、72及96 h的細胞上清液中纖連蛋白（FN）水平。結(jié)果 與對照組相比，青蒿素組、順鉑組和青蒿素+順鉑組均可呈時間依賴方式提高增殖抑制率，青蒿素+順鉑組在24、48、72和96 h后的增殖抑制率均高于青蒿素組和順鉑組（P＜0.05）；3組處理后的早、晚期凋亡率及E-cadherin水平均高于對照組，而N-cadherin、Vimentin水平及上清液FN水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與青蒿素組和順鉑組相比，青蒿素+順鉑組的早、晚期凋亡率及E-cadherin水平較高，N-cadherin和Vimentin水平及上清液FN水平較低，以上差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論 青蒿素和順鉑對胃癌SGC-7901細胞均有細胞毒性，如抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡及抑制EMT；同時，青蒿素聯(lián)合順鉑對胃癌細胞具有協(xié)同增效的作用。

關(guān)鍵詞:青蒿素；順鉑；胃癌；增殖；凋亡；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.044

胃癌是目前困擾全球的惡性腫瘤，作為最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其死亡率位居惡性腫瘤第2位；而我國作為胃癌高發(fā)國家之一，近年來其發(fā)病率有逐年上升的趨勢，防治形勢嚴峻［1］。順鉑是治療惡性腫瘤的常用化療藥物，其可抑制癌細胞的DNA復(fù)制過程，具有較強的廣譜抗癌作用，但化療耐藥在臨床上較為常見［2］。青蒿素是一種從中藥青蒿中分離出來的活性成分，臨床上用于瘧疾的治療，近年來研究發(fā)現(xiàn)該藥還具有較強的抗癌活性［3-5］。故推測青蒿素對胃癌也有較好的作用，因此，本研究探討青蒿素聯(lián)合順鉑對胃癌SGC-7901細胞增殖和凋亡的影響，并進一步驗證其對胃癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（ePithe1ia1mesenchyma1 transition，EMT）的作用，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與儀器

1.1 細胞株 胃癌SGC-7901細胞株購自中國科學院上海細胞所。

1.2 藥物和試劑 青蒿素、MTT及十二烷基硫酸鈉（SDS）購自美國Sigma-A1drich公司；順鉑購于江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司；PMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清及雙抗（青霉素、鏈霉素）均購自美國Hyc1one公司；Annexin-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；胎牛血清來自杭州四季青生物工程公司；E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、FN及GAPDH抗體購自美國Ce11Siga1ing Techno1ogy公司。

1.3 儀器 BX51型倒置顯微鏡（日本O1ymPus公司）；ZS-2型全自動酶標儀（中國科學院生物物理研究所）；FACSCa1ibur型式細胞儀（美國BD公司）；BG-sub MIDI型多用途水平電泳儀，（美國Baygene公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 將SGC-7901細胞置于RPMI-1640培養(yǎng)基中常規(guī)條件培養(yǎng)，具體為10％胎牛血清、1×105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素，37℃、5％ CO2飽和濕度，每隔2～3 d換液，待其達80％～85％融合時進行后續(xù)實驗。

2.2 細胞增殖檢測 取對數(shù)生長期SGC-7901細胞，胰蛋白酶消化細胞后制備單細胞懸液，以1×105個/孔接種96孔培養(yǎng)板，待其穩(wěn)定培養(yǎng)24 h后，分別進行50 μmo1/L青蒿素、10 mg/L順鉑單用或聯(lián)合處理，根據(jù)實驗設(shè)計將SGC-7901細胞分為4組:對照組、青蒿素組、順鉑組和青蒿素+順鉑組，對照組僅加入培養(yǎng)基，不給予任何藥物處理；在常規(guī)條件下依次培養(yǎng)24、48、72和96 h后，每孔加入10 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mLMTT溶液，孵育4 h后在全自動酶標儀上以492 nm波長讀取吸光值A(chǔ)，根據(jù)公式計算增殖抑制率（％）=1-A給藥組/A對照組×100％。各濃度設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2.3 流式細胞術(shù) 將SGC-7901細胞按1×106個/孔接種培養(yǎng)板中，根據(jù)以上分組實施相應(yīng)處理，于處理24、48 h后收集各組細胞，依次經(jīng)PBS沖洗、冷乙醇固定及核糖核酸酶（RNase）處理后，根據(jù)凋亡檢測試劑盒說明書進行后續(xù)操作，加入Annexin V/FITC和PI進行染色，避光染色15 min后上機，采用流式細胞儀測定凋亡率。

2.4 免疫印跡 收集處理48 h后的各組細胞，冰上加入細胞裂解液，裂解后高速離心（10 000 r/min，30 min），收集上清液后采用二喹啉甲酸（BCA）法檢測蛋白濃度，取等量蛋白行常規(guī)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜處理后，根據(jù)膜面積依次加入適量E-cadherin、N-cadherin、Vimentin（除E-cadherin為1∶200外，其余均為1∶100），4℃孵育過夜，加入二抗（1∶3 000）室溫下?lián)u蕩孵育2 h，化學發(fā)光法顯影后，IPP 6.0軟件分析條帶光密度，最終結(jié)果表示為各條帶光密度與內(nèi)參GADPH的比值。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附法 收集各組處理24、48、72和96 h后的細胞上清液，采用針對FN的檢測試劑盒，根據(jù)試劑盒說明書檢測各組不同處理時間的上清液FN水平。

2.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件對本研究數(shù)據(jù)進行分析。數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標準差”表示，多組比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），兩兩比較采用Bonferroni法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 青蒿素聯(lián)合順鉑對SGC-7901細胞增殖的影響 采用MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，青蒿素組、順鉑組和青蒿素+順鉑組均可呈時間依賴方式提高增殖抑制率（P＜0.05）；其中青蒿素+順鉑組在24、48、72和96 h后的增殖抑制率均高于青蒿素組和順鉑組（P＜0.05）。見表1。

表1　青蒿素聯(lián)合順鉑對SGC-7 9 0 1細胞增殖抑制率的影響

3.2 青蒿素聯(lián)合順鉑對SGC-7901細胞凋亡的影響 采用Annexin-FITC/PI雙染法檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，其余三組處理24 h、48 h后的早晚期凋亡率均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；青蒿素+順鉑組處理24 h、48 h后的早晚期凋亡率均高于青蒿素組和順鉑組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2　各組處理2 4、4 8 h后細胞凋亡情況分析（％）

3.3 青蒿素聯(lián)合順鉑對EMT相關(guān)標記分子的影響 采用免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，其余三組處理48 h后的E-cadherin水平升高，N-cadherin和Vimentin水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；青蒿素+順鉑組處理后的E-cadherin水平高于青蒿素組和順鉑組，而N-cadherin和 Vimentin水平均低于青蒿素組和順鉑組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；順鉑組的Vimentin水平低于青蒿素組（P＜0.05），E-cadherin和N-cadherin水平與青蒿素組的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3　各組處理4 8 h后EMT相關(guān)標記分子的表達情況

3.4 青蒿素聯(lián)合順鉑對細胞上清液FN水平的影響 采用ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在24～96 h的時間范圍內(nèi)，其余三組的FN水平均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；青蒿素+順鉑組處理后的FN水平均低于青蒿素組和順鉑組（P＜0.05）；除48 h外，順鉑組處理后的FN水平均低于青蒿素組（P＜0.05）；隨著處理作用時間的增加，青蒿素組、順鉑組和青蒿素+順鉑組的FN水平均降低（P＜0.05），呈時間依賴方式。見表4。

表4　各組處理不同時間后細胞上清液FN水平變化（n g/m L）

4 討論

胃癌是一種惡性消化道腫瘤，由于其發(fā)病隱匿且缺乏有效篩查手段，目前大多數(shù)患者確診時已屬晚期，無法進行手術(shù)，故化療成為主要的治療手段。但較強毒副作用及耐藥是影響化療效果的主要因素，而開發(fā)抗癌效果強且毒副反應(yīng)較輕的藥物是腫瘤臨床工作者的當務(wù)之急［6］。青蒿素是世界范圍內(nèi)用于治療惡性瘧疾的臨床用藥，由于其具有副作用少，在臨床上使用較為廣泛。隨著研究的發(fā)現(xiàn)，青蒿素及其衍生物具有較強的抗癌效果，如抑制細胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制血管和淋巴結(jié)生成［7-8］。王燕等［3］發(fā)現(xiàn)青蒿素類藥物對結(jié)腸腺癌細胞LS174T有細胞毒作用，可呈濃度和時間依賴性抑制細胞增殖。Tan等［4］發(fā)現(xiàn)青蒿素可通過激活蛋白激酶信號來抑制神經(jīng)母細胞瘤增殖。故綜合以上證據(jù)，本研究推測青蒿素對胃癌有細胞毒性，同時可增強順鉑的細胞毒性。

本研究采用常用胃癌細胞株SGC-7901來探討青蒿素聯(lián)合順鉑的抗癌效果，發(fā)現(xiàn)青蒿素可增強順鉑對胃癌SGC-7901的細胞毒性，如呈時間依賴方式抑制細胞增殖，表現(xiàn)為細胞的增值抑制率升高，這與其他癌腫的細胞學研究結(jié)果一致，如結(jié)腸腺癌、神經(jīng)母細胞瘤及宮頸癌［3-5］。以上提示青蒿素具有較廣泛的抗癌效果，但也有研究表明青蒿素對不同種類癌細胞的細胞毒性存在差異，如小鼠肥大細胞瘤（P815）對該藥的敏感性強于地鼠腎細胞腺癌（BSR）［9］，表明青蒿素的細胞毒作用與癌細胞有關(guān)。此外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)其類似物二氫青蒿素同樣具有較強的抗癌效果，如王愛軍等［10］發(fā)現(xiàn)該藥物可抑制胃癌細胞增殖、粘附及侵襲等過程，而王紅鈺等［11］發(fā)現(xiàn)該藥物同樣可抑制胃癌的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)青蒿素可增強順鉑對胃癌的細胞毒性，提示兩者在抗腫瘤上具有協(xié)同作用，而Suberu等［12］在乳腺癌細胞中也發(fā)現(xiàn)了相同結(jié)論，如其發(fā)現(xiàn)青蒿素聯(lián)合順鉑處理乳腺癌MCF-7細胞的效果強于兩者單獨使用。以上表明青蒿素類藥物對胃癌細胞有確切的細胞毒作用，由于該藥物本身已用于臨床，故在抗癌藥物的開發(fā)及應(yīng)用上有較為廣闊的前景。

除抑制增殖外，本研究發(fā)現(xiàn)青蒿素還可誘導(dǎo)胃癌細胞SGC-7901的凋亡，如其處理后的早、晚期凋亡率均升高，其中在處理48 h后的早、晚期凋亡率均高于順鉑組，表明青蒿素誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡的能力要強于順鉑，此結(jié)果與陳衛(wèi)強［13］等人的研究結(jié)果相符；同時，本研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素可增強順鉑對胃癌細胞凋亡的誘導(dǎo)作用。順鉑為細胞周期非特異性藥物，可通過抑制癌細胞的DNA復(fù)制過程來誘導(dǎo)其凋亡，而對于青蒿素的作用機制目前尚無定論，有研究發(fā)現(xiàn)其可通過活性氧依賴途徑來誘導(dǎo)癌細胞凋亡［14］。此外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)青蒿素類似物可通過影響凋亡相關(guān)蛋白的表達或線粒體依賴性途徑來誘導(dǎo)癌細胞凋亡［15-16］。筆者將在下一步研究中探討青蒿素聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)胃癌凋亡的機制。

EMT是癌細胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要步驟，作為生理病理現(xiàn)象，以上皮細胞特性喪失及間質(zhì)細胞特性獲得為重要特征。EMT過程中介導(dǎo)上皮細胞間緊密連接的胞膜蛋白E-cadherin表達下調(diào)，間質(zhì)細胞間的連接蛋白如N-cadherin表達上調(diào)［17］。本研究發(fā)現(xiàn)青蒿素、順鉑單用或聯(lián)合使用均可升高上皮標記分子E-cadherin水平，同時降低間質(zhì)標記分子N-cadherin和Vimentin水平，以上結(jié)果表明青蒿素和順鉑均可抑制胃癌細胞的EMT過程。本研究采用ELISA法觀察另一間質(zhì)標記分子FN的水平動態(tài)變化，同樣發(fā)現(xiàn)青蒿素、順鉑單用或聯(lián)用均可降低其水平，進一步表明兩藥物均可抑制EMT過程?？傮w上兩者聯(lián)用效果強于單獨使用，表明青蒿素可增強順鉑對EMT過程的抑制作用。

綜上所述，青蒿素和順鉑對胃癌SGC-7901細胞均有細胞毒性，如抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡及抑制EMT，同時，青蒿素聯(lián)合順鉑對胃癌細胞具有協(xié)同增效的作用。

參考文獻:

［1］ 鄒文斌，李兆申.中國胃癌發(fā)病率及死亡率研究進展［J］.中國實用內(nèi)科雜志，2014，34（4）: 408-415.

［2］ 李恩喜，尹威民，王 旭，等.吉西他濱聯(lián)合順鉑方案在非小細胞肺癌術(shù)后輔助化療中的療效及影響因素分析［J］.吉林大學學報:醫(yī)學版，2013，39（1）: 122-127.

［3］ 王 燕，薛 丹，王銳利，等.青蒿素類藥物對結(jié)腸腺癌細胞LS174T的細胞毒作用［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，10 （7）: 14-16.

［4］ Tan W Q，Chen G，Jia B，et al.Artemisinin inhibits neurob1astoma Pro1iferation through activation of AHP-activated Protein kinase（AMPK）signa1ing［J］.Pharmazie，2014，69 （6）: 468-72.

［5］ Goodrich S K，Sch1ege1CR，Wang G，etal.Use ofartemisinin and its derivatives to treat HPV-infected/transformed ce11s and cervica1 cancer: a review［J］.Future Oncol，2014，10（4）: 647-654.

［6］ 金曉紅，朱志圖，史 毅，等.胃癌細胞TRAIL耐藥機制以及TRAIL聯(lián)合化療應(yīng)用的研究進展［J］.吉林大學學報:醫(yī)學版，2014，40（1）: 215-218.

［7］ 陸金健.青蒿素類化合物抗腫瘤研究進展［J］.中國藥理學通報，2010，26（6）: 818-820.

［8］ 呂江濤，楊 華，郎景和，等.青蒿素衍生物對宮頸癌細胞血管形成相關(guān)分子表達和人臍靜脈內(nèi)皮細胞血管形成能力的影響［J］.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2013，22（11）: 877-880.

［9］ Ti1aouiM，Mouse H A，Jaafari A，et al.Differentia1effect of artemisinin against cancer ce111ines［J］.Nat Prod BioProsPect，2014，4（3）: 189-96.

［10］ 王愛軍，馮俊偉，劉 萱，等.二氫青蒿素體外抑制胃癌細胞的黏附、遷移和侵襲［J］.中國老年學雜志，2012，32 （17）: 3716-3719.

［11］ 王紅鈺，王愛軍，劉 萱，等.二氫青蒿素聯(lián)合順鉑對胃癌SGC7901細胞增殖和耐藥因子表達的影響［J］.中國全科醫(yī)學，2012，15（27）: 3130-3134.

［12］ Suberu JO，Romero-Cane1ón I，Su11ivan N，etal.ComParative cytotoxicity of artemisinin and cisP1atin and their Interactions with ch1orogenic acids in MCF7 breast cancer ce11s［J］.Chem Med Chem，2014，9（12）: 2791-2797.

［13］ 陳衛(wèi)強，戚好文，吳昌歸，等.雙氫青蒿素和順鉑誘導(dǎo)人肺腺癌A549/CDDP細胞凋亡［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2007，15 （5）: 616-619.

［14］ Gangu1i A，Choudhury D，Datta S，et al.Inhibition of autoPhagy by ch1oroquine Potentiates synergistica11y anti-cancer ProPerty of artemisinin by Promoting ROS dePendent aPoPtosis［J］. Biochimie，2014，107（12）: 338-349.

［15］ 劉靜靜，費愛梅，聶瑞敏，等.新型青蒿素衍生物SM1044誘導(dǎo)Kasumi-1細胞凋亡及機制的研究［J］.中國實驗血液學雜志，2011，19（3）: 607-611.

［16］ 王愛軍，馮俊偉，王紅鈺，等.二氫青蒿素通過線粒體依賴性途徑誘導(dǎo)人胃癌細胞凋亡的機制［J］.中華實驗外科雜志，2012，29（7）: 1312-1314.

［17］ TiwariN，Ghe1dof A，TatariM，etal.EMT as the u1timate surviva1mechanism of cancer ce11s［J］.Semin Cancer Biol，2012，22（3）:194-207.

*通信作者:萬里新（1967—），女，碩士，主任醫(yī)師，從事腫瘤生物治療方面的研究。Te1:（0377）63200007，E-mai1: nanyang1967 @163.com

作者簡介:郭 錳（1981—），男，碩士，副主任醫(yī)師，從事腫瘤臨床與用藥方面的研究。Te1: 13838708698，E-mai1: 2558692910@ qq.com

收稿日期:2015-03-28

中圖分類號:R966

文獻標志碼:B

文章編號:1001-1528（2016）02-0431-04