臧巧真， 唐 濤， 龍凱花， 王春柳， 辛永潔， 李 曄*

（1.陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽712046；2.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西西安710003）

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Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化α-細(xì)辛腦長循環(huán)納米粒制備工藝

臧巧真1， 唐 濤1， 龍凱花1， 王春柳2， 辛永潔2， 李 曄2*

（1.陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽712046；2.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西西安710003）

摘要:目的 采用Box-Behnken效應(yīng)面法，優(yōu)化聚山梨酯80修飾的α-細(xì)辛腦長循環(huán)納米粒的制備工藝條件。方法 以MPEG-PLGA的濃度、MPEG-PLGA與藥物的比例和F68的濃度為考察因素，包封率和載藥量為評價(jià)指標(biāo)，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)安排，并用多元線性回歸及二項(xiàng)式擬合建立指標(biāo)與因素之間的數(shù)學(xué)關(guān)系，效應(yīng)面法預(yù)測最佳工藝條件。結(jié)果 各指標(biāo)的二項(xiàng)式擬合方程均優(yōu)于多元線性回歸方程，以優(yōu)化工藝條件下制備的納米粒的平均粒徑為（95.82±3.41）nm，包封率為（87.50±1.72）％，載藥量為（14.44±0.81）％。結(jié)論 該方法適用于α-細(xì)辛腦納米粒的工藝優(yōu)化，所建立數(shù)學(xué)模型的預(yù)測性良好。

關(guān)鍵詞:α-細(xì)辛腦；長循環(huán)納米粒；聚山梨酯80；多元線性回歸；二項(xiàng)式擬合；Box-Behnken效應(yīng)面法

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.052

α-細(xì)辛腦［1］（2，4，5-三甲氧基-1-丙烯基苯）是天南星科植物石菖蒲的主要活性成分之一，又名α-細(xì)辛醚、細(xì)辛醚和細(xì)辛腦（asarone）。大量研究資料表明，α-細(xì)辛腦可通過提高腦組織的興奮閾，抑制來自病灶的興奮擴(kuò)散，從而對癲癇有良好的治療效果，并且毒副作用?。?］。由于它是脂溶性極強(qiáng)的化合物，故口服普通制劑的生物利用度低，如其膠囊劑和片劑僅分別為2.73％和5.56％［3］。因此，提高α-細(xì)辛腦的生物利用度及腦靶向性，具有重大意義。

普通的納米粒易被高吞噬性單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（Mononuc1ear Phagocyte System，MPS）識(shí)別和吞噬，從而富集于肝、脾等器官，使得藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間縮短［4］。研究表明，納米粒的表面用PEG、PEO、MPEGPLGA等親水性高分子材料修飾后，能形成水化保護(hù)層，并具備立體位阻效應(yīng)，從而不被MPS識(shí)別，達(dá)到長循環(huán)的目的［5］，而被聚山梨酯80修飾過的納米粒的腦靶向性明顯增強(qiáng)，研究表明，其可吸附血液中的APo B或E，從而通過LDL受體介導(dǎo)納米遞藥系統(tǒng)，經(jīng)胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)入腦［6-7］。

Box-Behnken效應(yīng)面法［8］具有方法簡便、實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、可采用三維效應(yīng)面進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、擬合和模型預(yù)測性好等優(yōu)點(diǎn)，是近年來國外藥學(xué)工作者常用的方法，適用于多因素多水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)。本實(shí)驗(yàn)制備聚山梨酯80修飾的α-細(xì)辛腦長循環(huán)納米粒，并采用Box-Behnken效應(yīng)面法對其制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 Agi1ent 1260色譜柱，包括G1311B四元泵、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G4212B二極管陣列檢測器、LAB oPen色譜數(shù)據(jù)工作站（美國Agi1ent公司）；Sartorius BP211D電子分析天平（十萬分之一，德國賽多利斯公司）；超純水系統(tǒng)，包括UFC501096超濾管（美國Mi11iPore公司）；KQ-250DE超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；HJ-6多頭磁力加熱攪拌器（常州國華電器有限公司）；R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士布琦公司）；TGL-18臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（長沙英泰儀器有限公司）；ZEN3600激光粒度儀（英國Mar1vern公司）；H-600透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）。

1.2 試藥 α-細(xì)辛腦對照品（中國食品藥品檢定研究院，供含有量測定用，純度100％，批號100298-201203）；α-細(xì)辛腦原料藥（湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司，純度98.0％）。MPEG-PLGA（50∶50，分子量20 000，山東濟(jì)南岱罡生物技術(shù)有限公司）；F68（德國BASF公司）；聚山梨酯80（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 表面修飾納米粒的制備 采用納米沉淀法制備納米粒［9］，稱取處方量的α-細(xì)辛腦和MPEG-PLGA，溶于適量丙酮中，形成有機(jī)相；取一定量的F68溶于水中，形成水相。在勻速攪拌條件下，將有機(jī)相緩慢加入到水相，40℃減壓旋蒸，除去有機(jī)溶劑，0.45 μm微孔濾膜過濾，得到呈淡藍(lán)色乳光的納米粒膠體溶液。加入1％聚山梨酯80適量，勻速攪拌30 min，即得［10］。

2.2 HPLC分析方法建立

2.2.1 色譜條件［11］Agi1ent ZORBAX Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（70∶30）；檢測波長257 nm；柱溫35℃；流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取α-細(xì)辛腦對照品適量，甲醇溶解，配制成儲(chǔ)備液。精密吸取適量，分別配制成502.50、251.25、50.25、20.10、10.05、5.03 μg/mL的對照品溶液，進(jìn)樣并記錄峰面積。以各溶液質(zhì)量濃度對峰面積進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=40.301X-0.041 7（r= 0.999 9），表明α-細(xì)辛腦在5.03～502.50 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 精密度考察 取3種不同質(zhì)量濃度的α-細(xì)辛腦對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，RSD分別為0.08％、0.1％和0.14％，表明儀器精密度良好。

2.2.4 回收率測定 分別取3種濃度的α-細(xì)辛腦對照品溶液，加入空白納米粒溶液，3 000 r/min離心30 min，測定超濾液中α-細(xì)辛腦的含有量。結(jié)果，回收率分別為98.21％、101.56％、99.41％，RSD分別為0.83％、1.01％、0.98％。

2.2.5 包封率和載藥量的測定［12］采用超濾法測定包封率（EE）和載藥量（DL）。取制備好的納米粒膠束溶液0.5 mL，置于Mi11iPore超濾離心管中，3 000 r/min離心30 min。精密量取續(xù)濾液200 μL，甲醇定容至2 mL，再精密量取納米粒膠束溶液200 μL，甲醇超聲破乳。HPLC法測定游離α-細(xì)辛腦及總藥物的濃度，按下式計(jì)算包封率和載藥量。

包封率=［（總藥量-游離藥物量）/總藥量］×100％；載藥量=［（總藥量-游離藥物量）/納米粒質(zhì)量］×100％

2.3 優(yōu)化設(shè)計(jì)

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對α-細(xì)辛腦納米粒制備影響較顯著的3個(gè)因素，即有機(jī)相中載體材料MPEG-PLGA的質(zhì)量濃度（X1）、MPEG-PLGA與藥物的用量比（X2）和水相中F68的質(zhì)量濃度（X3），進(jìn)行優(yōu)化研究。以α-細(xì)辛腦納米粒的包封率（Y1）和載藥量（Y2）為響應(yīng)值，建立數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化制備工藝。實(shí)驗(yàn)因素水平表及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表1和表2。

表1　Bo x-Be h n k e n試驗(yàn)因素水平及編碼

2.3.2 模型擬合 采用Design ExPert8.05實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件，分別對Y1和Y2與各因素間的關(guān)系進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式方程擬合。由擬合方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)r值和P值可知，二項(xiàng)式方程擬合的效果較好，各因素對包封率和載藥量均有影響，方差分析結(jié)果見表3和表4。多元線性回歸方程為Y1=85.401 13 +0.741 00X1-0.834 50X2-1.579 17X3（r=0.634 1，P=0.003 6），Y2=20.794 51 +0.038 00X1-1.352 50X2-0.259 72X3（r=0.898 0，P＜0.000 1）；二項(xiàng)式方程為Y1=64.553 20 +3.146 42X1+3.141 10X2-9.097 31X3-0.010 200X1X2+0.243 89X1X3+0.360 00X2X3-0.129 86X21-0.284 64X22+1.081 48X23（r=0.907 9，P= 0.006 8），Y2=21.383 69 +1.044 07X1-2.846 19X2+ 0.108 92X3-0.010 800X1X2+0.036 667X1X3-0.105 56X2X3-0.048 270X21+0.114 52X22+0.025 617X23（r=0.979 2，P＜0.000 1）。

表2　Bo x-Be h n k e n試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3　二項(xiàng)式回歸模型顯著性檢驗(yàn)（包封率）

表4　二項(xiàng)式回歸模型顯著性檢驗(yàn)（載藥量）

2.3.3 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測 應(yīng)用Design ExPert 8.05實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件，繪制各因素對響應(yīng)值的三維效應(yīng)面，結(jié)果見圖1。由圖可知，α-細(xì)辛腦納米粒的包封率Y1受X1、X2影響顯著，隨著MPEG-PLGA濃度的增加，包封率增加，而隨著MPEG-PLGA與藥物的用量比的增加，包封率下降；其載藥量Y2受X2的影響最為顯著，隨著MPEG-PLGA與藥物的用量比的增加，載藥量降低，與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致。然后，根據(jù)效應(yīng)面選出各因素的最佳取值范圍，得到最優(yōu)工藝參數(shù)X1=11.35 mg/mL，X2=5，X3=0.2％，預(yù)測包封率Y1=90.68％，載藥量Y2=15.04％。

2.4 工藝驗(yàn)證 根據(jù)優(yōu)選的最佳工藝參數(shù)條件，制備3批樣品，與模型預(yù)測值進(jìn)行比較，結(jié)果見表5，發(fā)現(xiàn)各考察指標(biāo)實(shí)測值與預(yù)測值的差異較小，偏差均在5％以內(nèi)，表明該模型方程的預(yù)測性較好。同法制備3批未經(jīng)聚山梨酯80修飾的納米粒，測定其包封率為（84.35±2.01）％，載藥量為（14.13±0.52）％，與聚山梨酯80修飾的納米粒相比，兩者均稍有下降。

表5　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.5 納米粒形態(tài)觀察 分別取聚山梨酯80修飾和未修飾的納米粒膠束溶液適量，蒸餾水稀釋，滴于銅網(wǎng)上，2％磷鎢酸負(fù)染，15 min后透射電鏡觀察納米粒形態(tài)，見圖2。由圖可知，納米粒外觀呈圓形，形狀規(guī)則，外層有明顯的親水層。

2.6 粒徑及分布、表面電位的測定 分別取聚山梨酯80修飾和未修飾的納米粒膠束溶液適量，蒸餾水稀釋，測定粒徑大小、分布及Zeta電位，結(jié)果見圖3和圖4。由圖可知，未經(jīng)修飾納米粒的平均粒徑、分散指數(shù)和Zeta電位分別為（85.60±2.11）nm、0.105±0.020、（-21.6±1.7）mV，納米粒的粒徑較小，而且分布較窄，整個(gè)體系相對穩(wěn)定；聚山梨酯80修飾納米粒的平均粒徑、分散指數(shù)和Zeta電位分別為（95.82±3.41）nm、0.148±0.030、（-26.4±2.1）mV，修飾后的納米粒粒徑稍有增大，分布均勻，電位絕對值增大，整個(gè)體系更加穩(wěn)定。

圖1　各因素與響應(yīng)值的三維圖

圖2　未經(jīng)修飾和經(jīng)聚山梨酯8 0修飾納米粒的透射電鏡圖（×20 000）

圖3　未經(jīng)修飾和經(jīng)聚山梨酯8 0修飾納米粒的粒徑分布圖

圖4　未經(jīng)修飾和經(jīng)聚山梨酯8 0修飾納米粒的電位分布圖

3 討論

為了提高α-細(xì)辛腦的生物利用度及腦靶向性，本實(shí)驗(yàn)采用可降解、生物相容性好的MPEG-PLGA作為長循環(huán)載體材料，制備了表面修飾的α-細(xì)辛腦納米粒。由透射電鏡圖可以看出，納米粒親脂性內(nèi)核的表面有明顯的水化層，相關(guān)文獻(xiàn)表明，這種水化層具備一定的位阻效應(yīng)，從而逃避蛋白吸附和MPS吞噬，達(dá)到長循環(huán)的效果［13-14］。

本實(shí)驗(yàn)采用納米沉淀法制備納米粒，該方法是利用有機(jī)相與水相混溶時(shí)發(fā)生界面騷動(dòng)與溶劑體系轉(zhuǎn)換，使藥物包裹在聚合物中并不斷析出，從而形成納米粒。載藥量和包封率是評價(jià)納米粒制備工藝的重要指標(biāo)，兩者越高，表明制備工藝越好，而且影響因素很多，如制備方法、載體濃度、水相與有機(jī)相的比例、載體與藥物的用量比、表面活性劑的濃度、攪拌速度與溫度等。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對納米粒制備影響最顯著的3個(gè)因素，即載體濃度、載體與藥物的用量比和表面活性劑的濃度進(jìn)行考察。結(jié)果，所制得納米粒的包封率和載藥量較高，粒徑＜100 nm，并且分布均勻，適用于腦靶向給藥［15］。

均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)常用來優(yōu)化工藝、篩選處方，由于采用線性數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，故實(shí)驗(yàn)次數(shù)較少，但不能靈敏地考察各因素的交互影響，實(shí)驗(yàn)精密度不夠理想，無法精確得到最佳點(diǎn)。而Box-Behnken效應(yīng)面法可以彌補(bǔ)以上不足，采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，可以提高優(yōu)化效果。

納米粒包封率的測定方法有超速離心法、透析法、葡聚糖凝膠色譜法、超濾法等，目的均為將納米粒與游離藥物分離。本實(shí)驗(yàn)曾采用超速離心法，18 000 r/min離心1 h，發(fā)現(xiàn)納米粒不能完全沉降，包封率測定結(jié)果比實(shí)際偏低，分析原因可能是所制備的納米粒粒徑較小，單純依靠離心力不能有效地游離藥物與納米粒。因此，采用超濾離心法，在離心力的作用下，利用篩分原理對物質(zhì)進(jìn)行分離，從回收率試驗(yàn)結(jié)果可以看出，該方法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，而且操作簡單、快速，適用于納米粒的包封率測定。

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*通信作者:李 曄（1970—），女，博士，研究員，研究方向?yàn)橹兴幮滦徒o藥系統(tǒng)。Te1:（029）87251837，E-mai1: 1iye1sj@163.com

作者簡介:臧巧真（1991—），女，碩士，研究方向?yàn)橹兴幮滦徒o藥系統(tǒng)。Te1:（029）87251837，E-mai1: zangqiaozhen@163.com

基金項(xiàng)目:陜西省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃項(xiàng)目（2012KCT-18）

收稿日期:2015-05-12

中圖分類號:R944

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

文章編號:1001-1528（2016）02-0456-05