黎宗強，施開創(chuàng)，李鳳梅，王海清，張　珍，尹彥文

(1.廣西大學動物科學技術(shù)學院，廣西南寧 530005；2.廣西動物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧 530001)

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雞源致病性沙門菌耐藥表型與耐藥基因、血清群的相關(guān)性研究

黎宗強1，施開創(chuàng)2 *，李鳳梅1，王海清2，張珍1，尹彥文2

(1.廣西大學動物科學技術(shù)學院，廣西南寧 530005；2.廣西動物疫病預(yù)防控制中心，廣西南寧 530001)

摘要：為研究沙門菌分離株耐藥表型與耐藥基因和血清群之間的關(guān)系，對血清型鑒定為B群和D群的29株雞源致病性沙門菌，采用ATB VET藥敏試劑條法對19種抗菌藥物進行敏感性測定，應(yīng)用PCR對這些抗菌藥物19種相關(guān)耐藥基因進行檢測。結(jié)果表明，29株沙門菌分離株中，青霉素、苯唑西林的耐藥率最高(100%)，耐藥率超過50%的還有磺胺甲惡唑(82.76%)、鏈霉素(75.86%)、惡喹酸(75.86%)、氟甲喹(65.52%)、恩諾沙星(55.17%)、四環(huán)素(55.17%)、阿莫西林(51.72%)，而對大觀霉素、慶大霉素、安普霉素、多黏菌素E沒有出現(xiàn)耐藥性。所有29個分離株至少對6種抗菌藥物具有耐藥性，以6重～7重耐藥為主(占51.73%)，最高可達14重耐藥(占3.45%)。所檢測的19種耐藥基因中，共檢測到14種耐藥基因，其中blaTEM檢出率最高(100%)，檢出率超過40%的還有aadA1(62.07%)、Sul2(62.07%)、Sul3(51.72%)、tetA(48.28%)、qnrA(44.83%)，而blaPSE、aadA2、tetG、tetM、tetX未能檢出。所有29個分離株至少攜帶2種耐藥基因，以攜帶4種～6種耐藥基因為主(占79.31%)，最多者攜帶10種耐藥基因(占3.45%)。B血清群和D血清群的耐藥表型和耐藥基因攜帶率沒有明顯差異。結(jié)果表明，廣西雞源致病性沙門菌耐藥性及多重耐藥性非常普遍，耐藥表型與相關(guān)耐藥基因檢出率呈正相關(guān)，而與血清群之間無明顯的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：沙門菌；雞；耐藥表型；耐藥基因；血清群；相關(guān)性

沙門菌(Salmonella)屬于革蘭陰性菌，迄今已鑒定出2 500多種血清型，其中大多數(shù)對人和動物具有致病性，是重要的人獸共患病原菌[1-2]。沙門菌可以導(dǎo)致雞白痢、雞傷寒和禽副傷寒，嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展。各類抗菌藥物在畜牧業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，在防治動物疫病、防止人畜共患病、促進動物生產(chǎn)、改善生態(tài)環(huán)境等方面發(fā)揮了重大作用[3]。然而，由于長期使用抗菌藥物所造成的選擇性壓力，加上長期不規(guī)范、不合理用藥，甚至亂用和濫用，導(dǎo)致包括沙門菌在內(nèi)的細菌不斷出現(xiàn)耐藥及多重耐藥現(xiàn)象。此外，耐藥細菌可以通過質(zhì)粒等多種途徑水平傳播其耐藥性，使得沙門菌耐藥譜不斷擴大、耐藥細菌愈來愈多、多重耐藥日趨嚴重，不僅嚴重危害畜牧業(yè)生產(chǎn)，而且嚴重威脅公共衛(wèi)生安全，引起全球的共同關(guān)注[4-5]。由于致病性沙門菌血清型眾多，各地使用抗菌藥物的種類、頻率和習慣不同，使得不同國家、不同地區(qū)在同一時間或者同一國家、同一地區(qū)在不同時間分離到的雞源致病性沙門菌的優(yōu)勢血清型、耐藥特點有所差異，具有一定的地域性和時間性[6-8]。開展沙門菌的監(jiān)測和流行病學調(diào)查，及時掌握其流行及耐藥新特點，是有效防治雞沙門菌病的前提和基礎(chǔ)。本研究對前期從廣西分離鑒定并進行血清分群和定型的29株雞源致病性沙門菌分離株，采用ATB VET藥敏試劑條法進行藥敏試驗測定其耐藥表型，應(yīng)用PCR技術(shù)對相關(guān)耐藥基因進行檢測，旨在分析致病性沙門菌的耐藥表型、耐藥基因和血清群之間的關(guān)系，為科學防治雞沙門菌病提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)控菌株雞沙門菌標準株(CVCC538)，大腸埃希菌標準株(ATCC25922)，購自中國微生物菌種保藏中心。

1.1.2分離菌株29株雞源致病性沙門菌分離株(表1)，于2013年—2015年從廣西疑似沙門菌感染病死雞病料中，經(jīng)選擇培養(yǎng)基篩選、生化試驗、致病性試驗確定為致病性沙門菌屬，經(jīng)沙門菌A～F群“O”多價診斷血清進行玻片凝集試驗并對照國家標準《食品微生物學檢驗 沙門菌檢驗》(GB 4789.4—2010)附錄B《常見沙門菌抗原》進行血清分群和定型，用PCR進行鑒別分型。分離菌株由廣西動物疫病預(yù)防控制中心保存。

表1　29株雞源致病性沙門菌的血清型分布

1.1.3主要試劑細菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、PCR膠回收試劑盒、pMD-18T載體、2×TaqPCR MasterMix、Hind Ⅲ 及EcoR Ⅰ內(nèi)切酶、DNA Marker DL2 000，均購自寶生物工程(大連)有限公司；大腸埃希菌Dpα感受態(tài)細胞，購自北京天根生化科技有限公司；ATB VET藥敏試劑條，購自法國Bio-Merieux公司生物梅里埃中國有限公司。

1.2方法

1.2.1藥敏試驗參照BioMerieux ATB全自動鑒定及藥敏儀ATB VET藥敏試劑條法操作說明書操作。制備0.5 McFarland的菌懸液，取10 μL于ATB培養(yǎng)基中，混勻，于ATB VET藥敏條每孔接種135 μL菌懸液，37℃18 h～24 h，用ATB分析儀讀取結(jié)果并用相應(yīng)軟件進行分析。

1.2.2細菌DNA模板的制備取細菌培養(yǎng)液，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌總DNA，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3擴增耐藥基因引物的設(shè)計參照GenBank發(fā)表的耐藥基因序列及相關(guān)文獻[9-12]，運用軟件Oligo 6設(shè)計19對特異性引物(表2)，分別用于擴增3種β-內(nèi)酰胺類、3種氨基糖苷類、6種四環(huán)素類、3種磺胺類和4種氟喹諾酮類常見耐藥基因。PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR MasterMix 10 μL，特異性上、下游引物(25 pmol/μL)各0.5 μL，模板1 μL，滅菌雙蒸水補至20 μL。PCR擴增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃～57℃ 30 s，72℃ 45 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。

對耐藥基因PCR擴增產(chǎn)物，采用膠回收試劑盒回收、純化，連接pMD-18T載體、轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Dpα感受態(tài)細胞，陽性克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，送寶生物工程(大連)有限公司測序。

1.2.4耐藥表型、耐藥基因和血清群相關(guān)性分析根據(jù)分離菌株血清分型與藥敏試驗、耐藥基因檢測的結(jié)果，分析耐藥表型、耐藥基因和血清群之間的相關(guān)性。

2結(jié)果

2.1藥物敏感性試驗

29株沙門菌分離株對19種抗菌藥物的耐藥表型見表3。29株沙門菌分離株中，青霉素、苯唑西林的耐藥率最高(100%)，耐藥率超過50%的還有磺胺甲惡唑(82.76%)、鏈霉素(75.86%)、惡喹酸(75.86%)、氟甲喹(65.52%)、恩諾沙星(55.17%)、四環(huán)素(55.17%)、阿莫西林(51.72%)，而對大觀霉素、慶大霉素、安普霉素、多黏菌素E沒有出現(xiàn)耐藥性。此外，比較B和D血清群還發(fā)現(xiàn)，D群對卡那霉素、復(fù)方新諾明的耐藥率均為0，而B群則分別為6.67%(1/15)、13.33%(2/15)；D群對氟甲喹、惡喹酸的耐藥率達到100%，而B群則分別為33.33%、53.33%；B群對鏈霉素、惡喹酸、磺胺甲惡唑、四環(huán)素、多西環(huán)素具有較強的耐藥性，D群對阿莫西林、頭孢噻吩、頭孢哌酮、鏈霉素、恩諾沙星、磺胺甲惡唑也具有較強的耐藥性，耐藥率均超過50%。

在19種抗菌藥中，沙門菌除全部對大觀霉素、慶大霉素、安普霉素、多黏菌素E敏感外，對其他14種抗菌藥物均具有耐藥性，并且存在嚴重的多重耐藥現(xiàn)象(表4)。所有29個分離株，每個菌株至少對6種抗菌藥物具有耐藥性，6重耐藥最多(27.59%)，依次為7重(24.14%)、10重(17.24%)、11重(10.34%)、8重和12重(6.90%)、9重和14重(3.45%)耐藥。比較B和D血清群菌株發(fā)現(xiàn)，B群最低為6重耐藥，最高為14重耐藥，其中6重耐藥占46.67%(7/15)，7重耐藥占26.67%(4/15)，9重、11重、12重、14重耐藥均占6.67%(各為1/15)；D群最低為6重耐藥，最高為12重耐藥，其中6重耐藥占7.14%(1/14)，7重耐藥占21.43%(3/14)，8重耐藥占14.29%(2/14)，10重耐藥占35.71%(5/14)，11重耐藥占14.29%(2/14)，12重耐藥占7.14%(1/14)?？梢?，D群的多重耐藥現(xiàn)象相對于B群更加嚴重。

表2　用于擴增耐藥基因的PCR引物

2.2耐藥基因檢測

應(yīng)用PCR檢測19種耐藥基因，并對擴增產(chǎn)物進行回收、連接、轉(zhuǎn)化，對陽性克隆提取質(zhì)粒后進行測序、比對驗證，共檢測到14種耐藥基因，其中blaTEM檢出率最高(100%)，檢出率超過40%的還有aadA1(62.07%)、Sul2(62.07%)、Sul3(51.72%)、tetA(48.28%)、qnrA(44.83%)，而blaPSE、aadA2、tetG、tetM、tetX未能檢出(表5)。所有29個分離株，每個菌株至少攜帶2種耐藥基因，其中5種基因攜帶率最高(41.38%),其次為4種(20.69%)、6種(17.24%)、3種(10.34%)和2種、8種、10種(各3.45%)(表4)。此外，比較B和D群菌株還發(fā)現(xiàn)，B群中氟喹諾酮類的檢出種數(shù)、檢出率高于D群(除qnrA外)，D群未檢出qnrB和qepA基因；四環(huán)素類耐藥基因以tetA和tetC為主，B群tetA的攜帶率高達73.33%(11/15)，遠高于同群或D群的其他四環(huán)素類耐藥基因，B群可檢出tetB(13.33%)、而D群未檢出；磺胺類耐藥基因Sul1、Sul2和Sul3檢出率較高且分布相對均衡。

表3　29株致病性沙門菌分離株對19種抗菌藥的敏感性試驗

2.3耐藥表型、耐藥基因及血清群的相關(guān)性分析

29個分離株對β-內(nèi)酰胺類的耐藥率為100%、耐藥基因的檢出率為100%，耐藥表型與耐藥基因的符合率為100%；而相應(yīng)數(shù)據(jù)在氨基糖苷類分別為75.86%、62.07%及86.21%，在氟喹諾酮類分別為75.86%、65.52%及82.76%，在磺胺類分別為86.21%、82.76%及82.76%，在四環(huán)素類分別為62.07%、62.07%及86.21%(表6)。耐藥表型與耐藥基因總體符合率在82.76%～100%之間，其中B群在80%～100%之間，D群在71.43%～100%之間；對耐藥表型與耐藥基因進行相關(guān)性分析，總體相關(guān)系數(shù)r=0.930，其中B群相關(guān)系數(shù)r=0.849，D群相關(guān)系數(shù)r=0.665。而根據(jù)文獻[13]，當r≥0.8時，認為兩個變量具有很強的相關(guān)性，表明本研究29個分離株的耐藥表型與相關(guān)耐藥基因的攜帶密切相關(guān)。

B群與D群分離株對氨基糖苷類、多黏菌素類抗菌藥物的耐藥性類似，除對其中的鏈霉素具有耐藥性外，對其他均敏感。此外，總體而言，B群對β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率低于D群，而對磺胺類、四環(huán)素類抗菌藥物的耐藥率高于D群(表3、表6)。具體分析發(fā)現(xiàn)，同一血清群菌株對不同或相同抗菌藥物的耐藥率不同，而不同血清群對同一或不同抗菌藥物的耐藥率也不同(表3)。表明沙門菌分離株的耐藥性與其所屬的血清群沒有必然的關(guān)系。

3討論

細菌的耐藥機制非常復(fù)雜，主要包括細菌產(chǎn)生滅活酶與鈍化酶，破壞或修飾抗菌藥的活性結(jié)構(gòu)；細胞滲透性改變，使得抗菌藥不易或無法進入細胞內(nèi)到達作用靶位；細胞的外排泵外排作用，抗菌藥在菌體內(nèi)達不到有效濃度；藥物作用的位點改變，抗菌藥不能與其結(jié)合或結(jié)合力降低等[5]。由于抗菌藥物廣泛應(yīng)用造成的選擇性壓力，加上長期不合理用藥甚至濫用，導(dǎo)致沙門菌產(chǎn)生耐藥甚至多重耐藥。世界各地分離到的雞源致病性沙門菌，其耐藥性有所差異，表現(xiàn)出一定的地域性和時間性[9，14]。在國內(nèi)，河南省沙門菌分離株對紅霉素、青霉素、阿齊霉素和氨芐西林的耐藥率均在60%～100%之間，三重以上耐藥高達96.94%，最多可耐18種抗菌藥[10]；黑龍江省沙門菌對氨芐西林、四環(huán)素、復(fù)合磺胺、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星的耐藥率均超過30%，但對慶大霉素和卡那霉素均敏感[11]；北京市和陜西省沙門菌對多黏菌素E的耐藥性最強，耐藥率達到41.82%，對磺胺異惡唑、氨芐西林和多西環(huán)素的耐藥率均超過20%)[15]；江蘇省沙門菌分離株對甲氧胺嘧啶、阿米卡星、慶大霉素、萘啶酮酸、諾氟沙星的耐藥率均在72.73%～100%之間，存在5種耐藥表型，每種耐藥表型均在4重或4重以上[16]。本研究中，29株沙門菌對青霉素、苯唑西林的耐藥率達到100%，耐藥率超過50%的有磺胺甲惡唑、鏈霉素、惡喹酸、氟甲喹、恩諾沙星、四環(huán)素、阿莫西林等(表3)，而對大觀霉素、慶大霉素、安普霉素、多黏菌素E沒有出現(xiàn)耐藥性。以上結(jié)果表明，各地雞源致病性沙門菌的耐藥性及多重耐藥現(xiàn)象非常嚴重，同時各地的耐藥譜有所差異，應(yīng)加強監(jiān)測，有針對性地用藥，以確保藥效。

表4　29株致病性沙門菌分離株耐藥性及耐藥基因檢測結(jié)果

表5　29株致病性沙門菌分離株耐藥基因的檢測

表6　29株致病性沙門菌分離株耐藥性、耐藥基因及血清型相關(guān)性分析

細菌耐藥性與其本身特性、耐藥基因的傳播和藥物的使用情況等因素有關(guān)，其中耐藥性的流行與耐藥基因的存在關(guān)系密切[17]。本研究對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類和磺胺類等五大類抗菌藥物19種常見耐藥基因的檢測中，共檢出14種耐藥基因，檢出率由高到低依次為blaTEM、aadA1、Sul2、Sul3、tetA、qnrA、Sul1、tetC、qnrS、blaCMY、Aph(3)-IIa、qnrB、qepA、tetB(表5)，而blaPSE、aadA2、tetG、tetM、tetX未能檢出。所有29個分離株，每個菌株至少攜帶2種耐藥基因，其中5種基因攜帶率最高(41.38%)，其后依次為4種(20.69%)、6種(17.24%)、3種(10.34%)和2種、8種、10種(各3.45%)。可見，與普遍存在的耐藥性及多重耐藥性相一致，耐藥基因及多重耐藥基因的攜帶率非常高。已有的報道提示，耐藥基因的攜帶在不同國家和地區(qū)也呈現(xiàn)一定的地域和時間差異[5-6，18-19]。就國內(nèi)而言，本研究中，β-內(nèi)酰胺類的blaTEM基因檢出率高達100%，而blaPSE基因未檢出，這與Lu Y等[9]報道山東省blaTEM檢出率為81.20%基本一致，而與王元蘭等[20]報道安徽省blaPSE檢出率高達85.7%不一致；氨基糖苷類的aadA1基因檢出率較高(62.07%)，高于江蘇(27.27%)[16]、黑龍江(3.4%)[11]、安徽(0)[20]的檢出率；氟喹諾酮類qnrA(44.83%)、qnrS(27.59%)檢出率較高，高于Wang Y等[19]報道的六省兩市qnrA(4.80%)、qnrS(0.80%)的檢出率以及Lu Y等[9]對山東省的報道(均未檢出qnrA、qnrS)；磺胺類耐藥基因Sul1、Sul2、Sul3的檢出率分別為31.03%、62.07%、51.72%，而董睿等[21]未能從陜西省沙門菌檢出sul1，戴建華等[16]未能從江蘇省、王元蘭等[20]未能從安徽省的沙門菌檢出Sul3；四環(huán)素類以tetA(48.28%)、tetC(27.59%)基因為主，而黑龍江省以tetA(44.80%)和tetB(44.80%)為主[11]，山東省則以tetA(82.50%)為主且未能檢出tetB和tetC基因[22]。以上結(jié)果說明不同地區(qū)雞源沙門菌耐藥基因的攜帶有其地域和時間特點，這可能與各地用藥種類、時間、習慣、頻率不同有關(guān)。值得注意的是，研究中發(fā)現(xiàn)有少數(shù)沒有耐藥表型的菌株也能檢出相應(yīng)的耐藥基因，而部分菌株表現(xiàn)出耐藥卻未能檢出相應(yīng)的耐藥基因，其機制有待于進一步研究。

本研究中，雞源致病性沙門菌分離株耐藥現(xiàn)象嚴重，耐藥基因攜帶普遍，對5大類抗菌藥物的耐藥表型與耐藥基因進行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r=0.930，說明兩者存在明顯的正相關(guān)。以鼠傷寒沙門菌為主的B血清群和以雞白痢沙門菌為主的D血清群，相關(guān)系數(shù)分別為0.849和0.665，其耐藥表型與耐藥基因均呈正相關(guān)。分析B群和D群的耐藥性，發(fā)現(xiàn)同群沙門菌對同一種類或不同種類抗菌藥的耐藥率不同，不同群沙門菌對同一種類或不同種類抗菌藥的耐藥率也不同，即：耐藥率與沙門菌所屬的血清群無關(guān)。表明致病性沙門菌分離株的耐藥表型與耐藥基因密切相關(guān)，而與血清群沒有明顯相關(guān)性。

本研究通過對廣西雞源致病性沙門菌新近分離株的耐藥表型和耐藥基因進行檢測和分析，發(fā)現(xiàn)耐藥性及多重耐藥性非常嚴重，耐藥基因及多重耐藥基因攜帶非常普遍，并且耐藥表型與耐藥基因存在密切關(guān)系，而與血清群沒有明顯相關(guān)性。應(yīng)加強臨床流行毒株及其耐藥特點的監(jiān)測，以有效防治雞沙門菌病。

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Correlation Analysis of Antimicrobial Resistance,Resistance Genes and Serogroup of PathogenicSalmonellaIsolates from Chickens

LI Zong-qiang1，SHI Kai-chuang2, LI Feng-mei1,WANG Hai-qing2,ZHANG Zhen1,YIN Yan-wen2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi,530005,China;2.GuangxiCenterforAnimalDiseaseControlandPrevention,Nanning,Guangxi,530001,China)

Abstract:To investigate the relationships among antimicrobial resistance,resistance genes and serogroup,29 pathogenic Salmonella isolates from chickens,belonging to B and D serogroup by slid agglutination test,were tested for the antimicrobial resistance against 19 antimicrobials by the ATB VET method and were detected for 19 relevant drug-resistant genes by PCR method.The results showed that the resistant rate over 50% of all the 29 isolates was most frequently found to be penicilline and oxacilline (100%),followed by sulfamethizol (82.76%), streptomycine (75.86%),oxolinique (75.86%),flumequine (65.52%),enrofloxacine (55.17%),tetracycline (55.17%) and amoxicilline (51.72%),while all the 29 isolates were senstive to spectinomycine,gentamicine,apramycine and polymyxin E.In addition,all the 29 isolates were resistant to at least 6 antimicrobials,and 6 and 7 multidrug resistances were the most common (51.73%),even 14 antimicrobials (3.45%).Of all the 19 resistance genes detected,14 resistance genes could be detected,and the positive rate over 40% was most frequently carried with blaTEM (100%),followed by with aadA1 (62.07%),Sul2 (62.07%),Sul3 (51.72%),tetA (48.28%),qnrA (44.83%),while blaPSE,aadA2,tetG,tetM and tetX could not be detected.At least 2 resistance genes were detected in all the 29 isolates, and most isolates harboured 4-6 resistance genes (79.31%), even 10 genes (3.45%). There was no obvious difference of antimicrobial resistance and resistance genes between B and D serogroups.The results suggested that antimicrobial resistance and multidrug resistance of pathogenic Salmonella isolated from chickens in Guangxi province were very common,and the antimicrobial resistant phenotype was positively correlated with resistance genes,while no significant correlation with serogroups was observed.

Key words:Salmonella;chicken;antimicrobial resistant phenotype;resistance gene;serogroup;correlation

文章編號:1007-5038(2016)03-0025-08

中圖分類號:S852.612;S859.7

文獻標識碼:A

作者簡介：黎宗強(1964-)，男，廣西玉林人，副教授，博士，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學的教學與科學研究。*通訊作者

基金項目：廣西水產(chǎn)畜牧科技項目(桂漁牧科1304559)

收稿日期：2015-04-25