韓彩靜, 金 磊, 林新明, 林東森, 程玉蕾, 程安瑋

(1.棲霞市農(nóng)業(yè)局農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全管理辦公室,山東棲霞 265300; 2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所,山東濟(jì)南 250100)

?

藍(lán)莓不可萃取多酚的純化及組分分析

韓彩靜1,2, 金 磊1, 林新明1, 林東森1, 程玉蕾1, 程安瑋2,*

(1.棲霞市農(nóng)業(yè)局農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全管理辦公室,山東棲霞 265300; 2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所,山東濟(jì)南 250100)

摘 要:對(duì)藍(lán)莓果實(shí)中不可萃取多酚進(jìn)行了提取、分離和純化,并利用高效液相色譜對(duì)其組成成分進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,7種大孔樹脂中HPD-100C對(duì)藍(lán)莓不可萃取多酚的吸附率和解吸率都相對(duì)較高;采用大孔樹脂HPD-100C進(jìn)行動(dòng)態(tài)純化,再利用高效液相色譜分析其組分,得出藍(lán)莓不可萃取多酚中主要物質(zhì)為飛燕草色素、矢車菊色素、牽?；ㄉ?、芍藥花色素、錦葵色素,與可萃取多酚相似,說明兩者具有相似組分。

關(guān)鍵詞:不可萃取多酚;純化;組分分析

HAN Caijing,JIN Lei,LIN Xinming,et al.Purification and composition analysis of non-extractable polyphenols in blueberry[J].Journal of Food Science and Technology,2016,34(1):50-54.

*程安瑋,女,副研究員,博士,主要從事食品新資源開發(fā)方面的研究。通信作者。

藍(lán)莓(Vaccinium corymbosum L.)屬于杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)植物。果實(shí)營養(yǎng)豐富,除了常規(guī)的糖和酸,還富含多酚、維生素、SOD、熊果苷、蛋白質(zhì)、花青苷、食用纖維以及K、Fe、Zn、Ca等礦物質(zhì)。多酚類化合物是指分子結(jié)構(gòu)中有若干個(gè)酚羥基的植物成分的總稱,包括黃酮類、單寧類、酚酸類以及花色苷類等。研究表明藍(lán)莓多酚具有抗氧化[1]、抗炎[2]、抗腫瘤[3]、改善記憶力[4]、抑菌[5]等功效。

近幾年,國內(nèi)外學(xué)者根據(jù)多酚的結(jié)合方式和萃取方法的不同,將多酚分為可萃取多酚(extractable polyphenols,EPP)和不可萃取多酚(non-extractable polyphenols,NEPP)[6]?，F(xiàn)在文獻(xiàn)所指的多酚大多指EPP,對(duì)于EPP的分離純化技術(shù)比較成熟,但有關(guān)NEPP分離純化的報(bào)道較為少見,關(guān)于其組分分析尤其是藍(lán)莓中不可萃取多酚的組分研究更少。本文從藍(lán)莓中提取NEPP,通過加堿中和、抽濾、用透析袋除去小分子等方法純化,借助高效液相色譜分析鑒定各組分,旨在為工業(yè)化提取藍(lán)莓果實(shí)中不可萃取多酚及藍(lán)莓的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮藍(lán)莓購于濟(jì)南市場,進(jìn)口品種,商品名為Midgold；大孔樹脂AB-8、DA-201、ADS-17、HPD-826、HD-20、HPD-750,上海摩速科學(xué)器材有限公司；大孔樹脂HPD-100C,鄭州勤實(shí)科技有限公司；茶多酚(tea polyphenols,TP)標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞98%),上海惠城生物科技有限公司；福林酚試劑、沒食子酸、甲酸、乙腈,Sigma公司；無水乙醇(分析純),天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

1200 series型高效液相色譜儀,美國安捷倫公司；色譜柱為Zorbax C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；MS104S型分析天平,瑞士Mettler公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藍(lán)莓NEPP粗提液的制備

新鮮藍(lán)莓打漿后冷凍干燥成粉,以φ(乙醇)為55%溶液作為萃取液,按料液比1：25 g/mL(即藍(lán)莓粉質(zhì)量與萃取液體積的比例),常溫下400 W超聲提取1.5 h,然后4 000 r/min離心5 min,分離上清液和沉淀。在沉淀中重新加入φ(乙醇)=55%溶液,重復(fù)一次。合并2次提取的上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇[7]。將沉淀在50℃條件下烘干,打碎成細(xì)粉,加入φ(硫酸)=10%的甲醇溶液,按料液比1：21 g/mL(即沉淀細(xì)粉質(zhì)量與甲醇溶液體積的比例),在74℃水浴中提取22.5 h,然后4000 r/min離心5 min,分離上清液和沉淀,上清液即為NEPP粗提液[8]。

1.3.2 藍(lán)莓NEPP的純化

1.3.2.1 濃縮

將萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到原體積的1/4,然后加NaOH中和至pH值為7。采用抽濾的方法過濾掉粗提過程中產(chǎn)生的雜質(zhì),然后用小分子透析袋將無機(jī)鹽分子和小分子用流動(dòng)的水充分透析,進(jìn)一步濃縮。

1.3.2.2 樹脂處理及裝柱

1)新樹脂用無水乙醇浸泡24 h,充分溶脹,用無水乙醇淋洗至洗出液無白色渾濁為止,再去離子水洗至無醇,吸干樹脂中的水分[9]。

2)處理好的樹脂采用濕法裝柱,先用蒸餾水充分洗凈層析柱,將預(yù)處理后的大孔樹脂置于大燒杯中并放入真空抽濾裝置中排出樹脂中的氣泡。先在層析柱中加入蒸餾水,放開層析柱底端的活塞至蒸餾水剩余高度約三分之一高度時(shí)關(guān)閉活塞。將大孔樹脂攪拌均勻在懸浮狀態(tài)下灌入層析柱中,快速打開層析柱下端活塞,同時(shí)繼續(xù)向?qū)游鲋屑尤氪罂讟渲列枰闹?。?倍柱體積蒸餾水平衡大孔樹脂柱,使其頂端平整柱體均一且樹脂高度不變[10]。

1.3.2.3 藍(lán)莓NEPP靜態(tài)吸附及解吸實(shí)驗(yàn)

將NEPP溶液稀釋2倍后抽濾,測(cè)其濃度。將已經(jīng)處理好的大孔樹脂真空抽濾,烘箱烘干。稱取干燥后的AB-8、DA-201、ADS-17、HPD-826、HD-20、HPD-750、HPD-100C樹脂各2 g,分別加入5,5,5,6, 6,6,8 mL上述稀釋后的NEPP溶液置于恒溫振蕩器上25℃振蕩24 h,進(jìn)行靜態(tài)吸附。然后測(cè)其吸附后剩余體積和多酚濃度,根據(jù)式(1)計(jì)算吸附率。

式(1)中,E為吸附率,%；C0為多酚溶液起始質(zhì)量濃度,mg/mL；C1為吸附后多酚質(zhì)量濃度, mg/mL；V0為多酚溶液起始體積,mL；V1為吸附后多酚體積,mL。

將樹脂用蒸餾水洗至流出液無色,用濾紙吸干表面水分,加入等體積的φ(甲醇)=80%的水溶液置于恒溫振蕩器上25℃振蕩24 h進(jìn)行解吸,測(cè)解析液體積和解吸后多酚濃度。根據(jù)式(2)計(jì)算解吸率。

式(2)中,D為解吸率,%；C2為解吸液中多酚質(zhì)量濃度,mg/mL；V2為解吸液體積,mL；C1為吸附后多酚質(zhì)量濃度,mg/mL；V1為吸附后多酚體積,mL。

1.3.2.4 藍(lán)莓NEPP動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

通過靜態(tài)實(shí)驗(yàn)確定最佳樹脂,然后進(jìn)行動(dòng)態(tài)純化。裝柱完成后,樣品以1.67 mL/min的流速吸附,吸附完成后(樣品液完全充滿整個(gè)柱子)用蒸餾水平衡0.5 h,用φ(甲醇)=80%的水溶液以5 mL/3 min的流速洗脫,用自動(dòng)部分收集器每3 min收集一管,測(cè)動(dòng)態(tài)吸附曲線。

1.3.3 藍(lán)莓NEPP色譜條件

以純化后的NEPP為原料進(jìn)行高效液相色譜分析。稱取10 mg純化的NEPP溶于10 mL的φ(甲醇)=80%的水溶液,上樣量10 μL,流速1 mL/min,柱溫25℃。流動(dòng)相A為φ(甲酸)=10%的水溶液,流動(dòng)相B為水：乙腈：甲酸=40：50：10。洗脫條件:0 min,88%A+12%B；26 min,70%A+30%B；40～43 min,0%A+100%B；48～50 min,88%A+12%B。測(cè)定波長為280 nm和520 nm,吸附率解吸率實(shí)驗(yàn)采用SPSS19軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,并進(jìn)行Tukey HSD差異顯著性分析,P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓NEPP靜態(tài)吸附率和解吸率

將藍(lán)莓NEPP粗提液進(jìn)行靜態(tài)吸附,在AB-8、DA-201、ADS-17、HPD-826、HD-20、HPD-750、HPD-100C等7種樹脂中選擇最佳樹脂,各樹脂的吸附率和解吸率如圖1。

由圖1可以看出,7種樹脂對(duì)藍(lán)莓NEPP的吸附率達(dá)到65%以上,其中HP-20和HPD-100 C的吸附率較高,而解吸率相對(duì)比較低,集中在20%～25%,綜合考慮吸附率和解吸率選擇HPD-100C進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附。

2.2 藍(lán)莓NEPP在HPD-100C樹脂的動(dòng)態(tài)吸附曲線

通過靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)選擇HPD-100C進(jìn)行動(dòng)態(tài)純化,動(dòng)態(tài)吸附曲線見圖2。

由圖2可以看出,動(dòng)態(tài)條件下HPD-100C樹脂上吸附的多酚物質(zhì)極易洗脫,從第4管就有多酚溶液洗脫下來,第5～9管的多酚濃度較高,一直洗脫到第15管,收集合并4～15管洗脫液,濃縮,測(cè)定總多酚的質(zhì)量濃度為230.22 ug/mL,冷凍干燥成粉,下一步實(shí)驗(yàn)備用。

圖1　藍(lán)莓NEPP靜態(tài)吸附率和解吸率Fig.1 Static adsorption and desorption rates of NEPP in blueberries

圖2　藍(lán)莓NEPP動(dòng)態(tài)吸附曲線Fig.2 Dynamic adsorption curve of NEPP in blueberries

圖3　藍(lán)莓NEPP高效液相色譜分析Fig.3 HPLC of NEPP in blueberries

2.3 藍(lán)莓NEPP高效液相色譜分析

參考EPP的組成分析方法[11-15],分別測(cè)定了280 nm和520 nm的吸收?qǐng)D譜,如圖3,各組分成分組成見表1。

表1　藍(lán)莓NEPP中各組成成分Tab.1 Major compounds in NEPP from blueberries

由圖3和表1可以看出,不同成分在色譜柱上保留時(shí)間不同,從而將各物質(zhì)分離,通過與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比確定各物質(zhì)的成分。藍(lán)莓NEPP的種類和含量都比較豐富,在280 nm下檢測(cè)到飛燕草色素-3-半乳糖苷、飛燕草色素-3-葡萄糖苷、矢車菊色素-3-葡萄糖苷、矢車菊色素-3-阿拉伯糖苷、牽?；ㄉ?3-葡萄糖苷、芍藥花色素-3-半乳糖苷、牽?；ㄉ?3-阿拉伯糖苷、錦葵色素-3-半乳糖苷、錦葵色素-3-阿拉伯糖苷9種成分及三種乙?；幕ㄉ?在520 nm下僅檢測(cè)到錦葵色素-3-半乳糖苷、飛燕草色素-3-葡萄糖苷兩種多酚類成分及兩種乙?；幕ㄉ??？偣矙z測(cè)到11種多酚類成分和3種乙?；幕ㄉ?。

3 討論與結(jié)論

藍(lán)莓中多酚的含量很高,每百克藍(lán)莓鮮果中花青苷色素含量0.07～0.15 g[11]。Somerset等[12]研究發(fā)現(xiàn),藍(lán)莓EPP中含有飛燕草素、錦葵花素、芍藥素、矮牽牛素等花青素。Lau等[13]研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓多酚中含有綠原酸,飛燕草色素-3-半乳糖苷,飛燕草色素-3-葡萄糖苷,矢車菊素-3-葡萄糖苷,牽牛花色素-3-葡萄糖苷和錦葵色素-3-葡萄糖苷。Tian等[14]也報(bào)道藍(lán)莓中含有飛燕草色素、矢車菊色素、錦葵色素、芍藥色素、牽?；ㄉ氐?-糖苷(糖苷分別為半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖)。Hosseinian等[15]對(duì)6種加拿大藍(lán)莓總花青苷含量進(jìn)行了含量鑒定,發(fā)現(xiàn)果實(shí)中錦葵花素含量較高。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到藍(lán)莓NEPP中含有2種飛燕草色素類、2種矢車菊色素類、2種牽?；ㄉ仡?、1種芍藥花色素類、2種錦葵色素了和3種乙?；幕ㄉ?其中以錦葵色素類為主,支持了前人的結(jié)論。以上結(jié)果說明,NEPP和EPP具有相似組分。矢車菊色素-3-半乳糖苷、飛燕草色素-3-阿拉伯糖苷、牽?；ㄉ?3-半乳糖苷在NEPP中沒有檢測(cè)到。在液相圖中出現(xiàn)了許多小峰值,目前尚不清楚其組分,有待于進(jìn)一步研究。

本文通過靜態(tài)吸附選擇HPD-100 C進(jìn)行動(dòng)態(tài)純化,在280 nm和520 nm下進(jìn)行高效液相分析,得出NEPP中的多酚成分以錦葵色素類為主,含有2種飛燕草色素類、2種矢車菊色素類、2種牽牛花色素類、1種芍藥花色素類、2種錦葵色素了和3種乙?；幕ㄉ?成分與EPP成分相似,說明兩者具有相似結(jié)構(gòu),從而推斷兩者具有相似活性。

參考文獻(xiàn):

[1]程安瑋,房凱,王文亮,等.藍(lán)莓多酚的萃取及抗氧化活性研究[J].北京工商大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2012,30(4):37-40.

[2]TORRI E,LEMOS M,CALIARI V,et al.Anti-inflammatory and antinociceptive properties of blueberry extract (Vaccinium corymbosum)[J].Journal of Pharm and Pharmacol,2007,59(4):591-596.

[3]YI W,FISCHER J,KREWER G,et al.Phenolic compounds from blueberries can inhibit colon cancer cell proliferation and induce apoptosis[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53(18):7320-7329.

[4]RAMIREZ M R,IZQUIERDO I,RASEIRA M C B,et al.Effect of lyophilised Vaccinium berries on memory, anxiety and locomotion in adult rats[J].Pharmacological research,2005,52(6):457-462.

[5]沈?yàn)t,孫曉紅,趙勇,等.藍(lán)莓提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2012,24:1622-1625.

[6]程安瑋,杜方嶺,王文亮,等.藍(lán)莓葉中可萃取多酚和不可萃取多酚提取的研究[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2011,42(11):1395-1398.

[7]韓彩靜,王文亮,陳相艷.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取藍(lán)莓多酚工藝[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2014,45(2):285-290.

[8]韓彩靜,謝春陽,陳相艷.藍(lán)莓不可萃取多酚的酸法提取工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào),2013,31 (5):29-34.

[9]李穎暢,鄭鳳娥,孟憲軍.大孔樹脂純化藍(lán)莓果中花色苷的研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2009,28 (4):496-500.

[10]周麗萍.Ralls蘋果多酚分離及抗氧化與脂肪代謝調(diào)節(jié)作用研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué),2010.

[11]胡雅馨,李京,惠伯棣.藍(lán)莓果實(shí)中主要營養(yǎng)及花青素成分的研究[J].食品科學(xué),2006,27(10):600-603.

[12]SOMERSET S M,JOHANNOT L.Dietary flavonoid sources in Australian adults[J].Nutrition and Canceran International Journal,2008,60(4):442-449.

[13]LAU F C,JOSEPH J A,MC DONALD J E,et al.Attenuation of iNOS and COX2 by blueberry polyphenols is mediated through the suppression of NF-κB activation[J].Journal of Functional Foods,2009,1(3):274-283.

[14]TIAN Q G,GIUSTI M M,STONER G D,et al.Screening for anthocyanins using high-performance liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass[J].Journal of Chromatography A,2005, 109(1):72-82.

[15]HOSSEINIAN F S,BETA T.Saskatoon and wild blueberries have higher anthocyanin contents than other Manitoba berries[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2007,55(26):10832-10838.

(責(zé)任編輯:李 寧)

Purification and Composition Analysis of Non-Extractable Polyphenols in Blueberry

HAN Caijing1,2, JIN Lei1, LIN Xinming1, LIN Dongsen1, CHENG Yulei1, CHENG Anwei2,*
(1.Management Office of Agricultural Product Quality and Safety,Agricultural Bureau of Qixia, Qixia 265300,China；2.Institute of Agro-Food Science and Technology,Shandong Academy of Agricultural Science,Jinan 250100,China)

Abstract:The extraction,separation and purification of non-extractable polyphenols(NEPP)in blueberries were studied and its components were analyzed using HPLC.The results showed that adsorption and desorption rates of HPD-100C were relatively high among seven kinds of macroporous resins.HPD-100C was used for dynamic purification and HPLC was applied for components analysis.The main components of NEPP were delphinidin,cyanidin,petunidin,peonidin,and malvidin,which is similar to those of extractable polyphenols(EPP).

Key words:non-extractable polyphenols；purification；composition analysis

作者簡介:韓彩靜,女,碩士,主要從事食品與農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)方面的工作；

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(31101270)。

收稿日期:2014-12-30

doi:10.3969/j.issn.2095-6002.2016.01.008

文章編號(hào):2095-6002(2016)01-0050-05

中圖分類號(hào):TS255.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

引用格式:韓彩靜,金磊,林新明,等.藍(lán)莓不可萃取多酚的純化及組分分析[J].食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào),2016,34(1):50-54.