薛紀(jì)森，陳騁，朱華，章圣輝，呂杰強(qiáng)，胡燕

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦科，浙江溫州 325027；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血液內(nèi)科，浙江 溫州 325015）

?

IL-17在高危型HPV陽(yáng)性宮頸癌中的表達(dá)

薛紀(jì)森1，陳騁2，朱華1，章圣輝3，呂杰強(qiáng)2，胡燕1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦科，浙江溫州 325027；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血液內(nèi)科，浙江 溫州 325015）

[摘 要]目的：通過(guò)檢測(cè)高危型人乳頭瘤病毒（HPV）陽(yáng)性宮頸癌患者體內(nèi)IL-17的表達(dá)水平，探討IL-17所介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)在高危型HPV感染的宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮的作用。方法：選取高危型HPV陽(yáng)性的宮頸浸潤(rùn)性鱗癌患者（宮頸癌組）28例、宮頸高危型HPV感染者（HPV感染組）25例以及對(duì)照組30例。采用ELISA法檢測(cè)各組患者外周血清及宮頸局部組織勻漿上清液中IL-17的表達(dá)水平。結(jié)果：①宮頸癌組患者外周血清中IL-17水平較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05），與HPV感染組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），HPV感染組與對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；②各組宮頸局部組織勻漿上清液中IL-17的表達(dá)水平均明顯高于外周血清表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；③宮頸局部組織勻漿上清液中IL-17表達(dá)水平各組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），且宮頸癌組局部組織勻漿上清液中IL-17的表達(dá)水平高于HPV感染組，HPV感染組高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論：IL-17所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可能參與并促進(jìn)了高危型HPV的持續(xù)性感染，與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]白細(xì)胞介素17；宮頸腫瘤；人乳頭瘤病毒

宮頸癌是引起女性死亡的第二大癌癥[1]，高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的持續(xù)性感染已被證實(shí)是發(fā)生宮頸病變的致病因素[2-3]。臨床上HPV感染多數(shù)呈一過(guò)性，只有10%～15%的高危型HPV呈慢性持續(xù)感染狀態(tài)，進(jìn)而引發(fā)宮頸癌變[4]。近來(lái)研究[5-7]發(fā)現(xiàn)，一類(lèi)獨(dú)特的效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞-輔助性T細(xì)胞l7（T helper 17 cells，Thl7）亞群，其分泌的特異性效應(yīng)因子白細(xì)胞介素17（interleukin-17，IL-17）在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中均發(fā)揮了重要的作用。本研究對(duì)高危型HPV陽(yáng)性的宮頸癌患者體內(nèi)IL-17表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，并與高危型HPV感染以及無(wú)HPV感染患者相比較，以探討IL-17介導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答在與高危型HPV感染相關(guān)的宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1　對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象 選取2010年12月至2011年7月赴溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院與附屬第二醫(yī)院婦科就診的宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）患者共28例作為宮頸癌組，均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)，且高危型HPV均為陽(yáng)性。另選取25例宮頸高危型HPV感染患者為HPV感染組，該組患者宮頸高危型HPV檢測(cè)均為陽(yáng)性，而宮頸液基細(xì)胞學(xué)篩查結(jié)果均提示“未見(jiàn)上皮內(nèi)病變及惡性病變”。選擇同期因子宮肌瘤在我院收治擬行子宮全切除術(shù)的30例患者作為對(duì)照組，術(shù)前經(jīng)宮頸液基細(xì)胞學(xué)及宮頸脫落細(xì)胞HPV篩查無(wú)異常。入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡為30～60歲女性；②非經(jīng)期；③近3 d無(wú)性生活。排除標(biāo)準(zhǔn)：①糖尿病、高血壓、冠心病、妊娠、生殖道及全身其他部位急、慢性感染性疾病、結(jié)締組織病、免疫性疾病或其他系統(tǒng)惡性腫瘤；②本次患病前曾接受過(guò)化療、放療或免疫抑制藥物治療；③乙型肝炎標(biāo)記物檢測(cè)表面抗原、e抗原、核心抗體三項(xiàng)中任何一項(xiàng)陽(yáng)性；④梅毒特異性抗體、丙型肝炎特異性抗體及HIV特異性抗體篩查陽(yáng)性。所有納入本研究的患者均行HPV基因分型檢測(cè)（凱普公司HPV基因分型檢測(cè)試劑盒）確定感染的高危型HPV型別。

1.2實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集 采集前告知患者標(biāo)本用途，表示同意并簽署知情同意書(shū)。①血清樣本采集：采集患者外周血2 mL，分離出血清后置-20 ℃保存待測(cè)；②組織標(biāo)本采集：宮頸涂抹盧戈氏液，在宮頸不著色區(qū)以活檢鉗鉗取宮頸病變組織，量約50 mg，標(biāo)記后置液氮罐中保存。主要試劑：人IL-17A ELISA檢測(cè)試劑盒、人IL-17A 標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；主要儀器：酶標(biāo)儀Thermo Multiskan MK3。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 ELISA法檢測(cè)血清及宮頸組織勻漿中IL-17的表達(dá)水平：取出組織塊，置于冰0.9%氯化鈉溶液中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，放入5 mL的小燒杯內(nèi)。以9倍于組織塊體積量取預(yù)冷的勻漿介質(zhì)PBS，用移液器取勻漿介質(zhì)PBS總量的2/3加入燒杯，置于冰水中使用眼科小剪快速將組織塊剪碎。將剪碎的組織倒入1 mL玻璃勻漿管中；用剩余的1/3勻漿介質(zhì)PBS沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿；左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)10次（6～8 min），充分研碎，使組織勻漿化。將制備好的10%組織勻漿在4 ℃，3 000 r/min離心10～15 min，取上清液，根據(jù)IL-17A ELISA試劑盒方法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出血清及宮頸組織勻漿樣本中IL-17濃度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布用±s描述；正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)后行方差分析，各組間兩兩比較采用Bonferroni法檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.13組臨床資料比較 各參數(shù)在3組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1　3組臨床資料比較

2.22研究組宮頸高危型HPV感染型別分布情況HPV感染組與宮頸癌組的HPV感染情況，單一型別感染為多數(shù)，HPV感染組為72%（18/25），宮頸癌組為78.57%（22/28），2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）；混合型別感染，HPV感染組為28%（7/25），宮頸癌組為21.43%（6/28），2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。全部HPV感染型別的分布中HPV16亞型最多見(jiàn)，占47.17%（25/53），其他較多見(jiàn)依次為HPV58亞型（20.75%，11/53）、HPV52亞型（16.98%，9/53）和HPV18亞型（11.32%，6/53）。見(jiàn)表2。

表2　2研究組中宮頸高危型HPV感染型別分布（例）

2.33組外周血清中IL-17水平比較 3組間外周血清中IL-17水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.206，P＜0.05）。宮頸癌組患者外周血清中IL-17水平與對(duì)照組比較有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但HPV感染組與宮頸癌組及對(duì)照組間比較IL-17水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1　3組間外周血清中IL-17水平比較

2.43組宮頸組織勻漿上清液中IL-17水平比較

每組宮頸局部組織勻漿上清液中IL-17的表達(dá)水平均明顯高于外周血清表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)圖2。宮頸局部組織勻漿上清液中IL-17水平在對(duì)照組、HPV感染組及宮頸癌組中呈逐漸升高的變化趨勢(shì)，3組間IL-17表達(dá)水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。宮頸癌組與HPV感染組比較IL-17表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；宮頸癌組與對(duì)照組比較IL-17水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HPV感染組與對(duì)照組比較IL-17表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

與血清比：aP＜0.05圖2　3組間宮頸組織勻漿上清液與外周血清中IL-17水平比較

3　討論

IL-17是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種促炎癥性細(xì)胞因子，主要由輔助性T細(xì)胞17（T helper 17 cells，Th17）亞群分泌，是機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答的主要參與者，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5-6]。隨著近年來(lái)研究的進(jìn)一步深入，IL-17細(xì)胞在許多疾病中的作用已受到廣泛關(guān)注。大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-17細(xì)胞在各種感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤、移植物抗宿主等疾病的發(fā)生和發(fā)展中均發(fā)揮了重要作用[8-12]。IL-17具有強(qiáng)大的招募、激活中性粒細(xì)胞的功能，是宿主抵御一些特殊病原體感染的重要細(xì)胞因子，參與了針對(duì)胞內(nèi)、外菌、真菌、寄生蟲(chóng)及病毒感染的免疫應(yīng)答過(guò)程。多數(shù)研究[8，13-14]提示，IL-17在病毒感染中發(fā)揮致病作用而不是保護(hù)性作用。而IL-17在病毒持續(xù)感染中發(fā)揮的作用機(jī)制，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究較少。在澳大利亞最近的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究中，研究者們認(rèn)為IL-17促進(jìn)了HPV的持續(xù)感染并引起宮頸上皮肉瘤變，IL-17可抑制宿主清除病毒感染細(xì)胞，延長(zhǎng)其生存時(shí)間，從而導(dǎo)致病毒的復(fù)制和持續(xù)性感染，引起宮頸病變[15]。

宮頸癌作為臨床最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程與生殖道高危型HPV的持續(xù)性感染有著密不可分的關(guān)系，高危型HPV感染清除的失敗將導(dǎo)致病毒的持續(xù)性感染和宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。HPV感染可激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。一般認(rèn)為，對(duì)HPV感染的有效免疫應(yīng)答主要是局部特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。目前有關(guān)該方面的研究結(jié)果尚不統(tǒng)一，且少有涉及IL-17和宮頸癌的相關(guān)性研究，IL-17是否參與了宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程，其在宮頸高危型HPV持續(xù)性感染中發(fā)揮了什么樣的作用，值得深入探究。

為明確IL-17介導(dǎo)的免疫反應(yīng)與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，本研究采用ELISA法檢測(cè)了外周血與宮頸組織勻漿上清液中IL-17的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，宮頸癌組患者外周血清中IL-17表達(dá)水平與對(duì)照組比較有升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），宮頸癌組IL-17表達(dá)水平雖高于HPV感染組、HPV感染組高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組宮頸組織勻漿上清液中IL-17的表達(dá)水平均明顯高于外周血清水平，且宮頸癌組高于HPV感染組，HPV感染組高于對(duì)照組，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。由此提示，局部組織勻漿上清液中IL-17的表達(dá)水平與外周血中IL-17的變化趨勢(shì)基本一致，證實(shí)了IL-17所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可能參與并促進(jìn)了高危型HPV的持續(xù)性感染，與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程相關(guān)，據(jù)本研究結(jié)果提示，宮頸局部組織中IL-17表達(dá)水平明顯高于外周血清，提示IL-17所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)變化可能在宮頸局部微環(huán)境中較為明顯。

IL-17所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可能參與并促進(jìn)了高危型HPV的持續(xù)性感染，與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程相關(guān)，為尋找有效阻斷宮頸高危型HPV慢性及持續(xù)性感染的免疫治療措施提供了新的理論依據(jù)，值得進(jìn)一步深入研究和探討。

參考文獻(xiàn)：

[1]FERLAY S H,BRAY F,FORMAN D,et al.GLOBOCAN 2008,cancer incidence and mortality worldwide:IARC Cancer Base number 10.Lyon,France:International Agency for Research on Cancer 2010[J].http://globocan.iarc.fr (accessed Aug 10,2010),2010.

[2]ZUR HAUSEN H.Papillomaviruses and cancer:from basic studies to clinical application[J].Nat Rev Cancer,2002,2(5):342-350.

[3]潘鎦鎦,鄭飛云,諸海燕,等.鴉膽子素D對(duì)HPV16感染細(xì)胞株的作用及其可能機(jī)制[J].溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015,45(2):89-94.

[4]COX J T.Epidemiology and natural history of HPV[J].J Fam pract,2006,Suppl:3-9.

[5]HARRINGTON L E,Hatton R D,Mangan P R,et al.Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages[J].Nat Immunol,2005,6(11):1123-1132.

[6]PARK H,LI Z,YANG X O,et al.A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue infl ammation by producing interleukin 17[J].Nat Immunol,2005,6(11):1133-1141.

[7]劉英平,陳揚(yáng).宮頸癌患者血清IL-17、VEGF水平檢測(cè)的臨床意義分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2013,17(11):2053-2054.

[8]DU W J,ZHEN J H,ZENG Z Q,et al.Expression of interleukin-17 associated with disease progression and liver fibrosis with hepatitis B virus infection:IL-17 in HBV infection[J].Diagn Pathol,2013,8:40.

[9]YEH C Y,SHUN C T,KUO Y M,et al.Activated human valvular interstitial cells sustain interlenkin-17 production to recruit neutrophils in infective endocarditis[J].Infect Immun,2015,83(6):2202-2212.

[10]KARBACH S,CROXFORD A L,OELZE M,et al.Interleukin 17 drives vascular inflammation,endothelial dysfunction,and arterial hypertension in psoriasis-like skin disease

[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2014,34(12):2658-2668.

[11]MORAN E M,MASTAGLIA F L.The role of interleukin-17 in immune-mediated inflammatory myopathies and possible therapeutic implications[J].Neuromuscul Disord,2014,24(11):943-952.

[12]BAHARLOU R,KHEZRI A,RAZMKHAH M,et al.Increased interleukin-17 transcripts in peripheral blood mononuclear cells,a link between T-helper 17 and proinfl ammatory responses in bladder cancer[J].Iran Red Crescent Med J,2015,17(2):e9244.

[13]SHI M,WEI J,DONG J,et al.Function of interleukin-17 and -35 in the blood of patients with hepatitis B-related liver cirrhosis[J].Mol Med Rep,2015,11(1):121-126.

[14]OHTA R,IMAI M,KAWADA J,et al.Interleukin-17A-producing T lymphocytes in chronic active Epstein-Barr virus infection[J].Microbiol Immunol,2013,57(2):139-144.

[15]GOSMANN C,MATTAROLLO S R,BRIDGE J A,et al.IL-17 suppresses immune effector functions in human papillomavirus-associated epithelial hyperplasia[J].J Immunol,2014,193(5):2248-2257.

（本文編輯：吳彬）

·論 著·

·論 著·

The expression of IL-17 in the cervical cancer with high-risk human papillomavirus infection

XUE Jisen1,CHEN Cheng2,ZHU Hua1,ZHANG Shenghui3,LYU Jieqiang2,HU Yan1.1.Department of Gynecology,the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015; 2.Department of Gynecology,the Second Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027; 3.Department of Hematology,the First Affi liated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015

Abstract:Objective:To investigate the expression of IL-17 in patients diagnosed as cervical squamous cell carcinoma (SCC) with high-risk human papillomavirus (HPV) infection,with the aim to explore the potential role of specifi c immune response mediated by IL-17 in the disease progression and carcinogenesis of cervical cancer which is closely associated with high-risk HPV infection.Methods:The study groups included 28 cervical SCC patients with high-risk HPV infection and 25 high-risk HPV infected women with normal cervical cytology.Thirty patients diagnosed as uterine myoma with normal cervical cytology and negative HPV testing were enrolled as the control group.The concentration of IL-17 in serum and supernatant of cervical tissue homogenate were examined with ELISA method.Results:①The serum concentrations of IL-17 in patients with cervical SCC were signifi cantly higher than those in the control group (P＜0.05),but there was no signifi cant difference observed between SCC group vs the high-risk HPV infection group (P＞0.05) and the high-risk HPV infection group vs the control group (P＞0.05); ②The average concentrations of IL-17 in supernatant of cervical tissue homogenate of all groups were obviously higher than those in serum respectively (P＜0.05); ③The concentrations of IL-17 in supernatant of cervical tissue homogenate differed signifi cantly among the study groups and the control group (P＜0.05).The concentrations in the cervical SCC group were higher than those in the high-risk HPV infected group,which were much higher than the control group (P＜0.05).Conclusion:These results indicate that the immune reaction mediated by IL-17 may participate in and promote the persistent infection of high-risk HPV,which is closely associated with the disease progression and carcinogenesis of cervical cancer cervical cancer.

Key words:IL-17; uterine cervical neoplasms; human papillomavirus

通信作者：胡燕，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，碩士生導(dǎo)師，Email：627830566@qq.com。

作者簡(jiǎn)介：薛紀(jì)森（1987-），男，浙江蒼南人，住院醫(yī)師，碩士。

基金項(xiàng)目：浙江省衛(wèi)生廳科研基金資助項(xiàng)目（2011KYA107）。

收稿日期：2015-03-31

[中圖分類(lèi)號(hào)]R737.33

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.01.005