黃平，張雪，陳光元，金瑛

(深圳市寶安區(qū)松崗人民醫(yī)院婦科，廣東深圳518105)

p16、Ki67、PHH3和HPV-L1在宮頸脫落細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義

黃平，張雪，陳光元，金瑛

(深圳市寶安區(qū)松崗人民醫(yī)院婦科，廣東深圳518105)

目的觀察p16基因、Ki67蛋白、核分裂特異性抗體(PHH3)及人乳頭瘤病毒L1型(HPV-L1)基因在宮頸病變脫落細(xì)胞的表達(dá)規(guī)律，并探討其臨床意義。方法選取2015年4月至2016年4月期間本院婦科收治的100例婦科病患者作為研究對(duì)象，取宮頸脫落細(xì)胞，行雜交捕獲Ⅱ代法人乳頭瘤病毒(HPV HC-Ⅱ)檢測(cè)和液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查，檢測(cè)并分析HPV-L1、PHH3、Ki67、p16的表達(dá)水平。結(jié)果宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢出未見(jiàn)上皮內(nèi)細(xì)胞病變(NILM)8例，非典型鱗狀上皮細(xì)胞/低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(ASCUS/LSIL)42例，非典型鱗狀上皮細(xì)胞不能排除高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變/高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(ASC-H/HSIL)41例，鱗狀細(xì)胞癌(SCC)9例。ASCUS/LSIL患者的Ki67、PHH3、p16陽(yáng)性檢出率分別為19.05%、4.76%、26.19%，均明顯低于ASC-H/HSIL患者的85.37%、88.89%、88.89%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；p16陽(yáng)性表達(dá)對(duì)宮頸癌及癌前病變的診斷敏感性、特異度分別為90.32% (56/62)、86.84%(33/38)，Ki67分別為83.87%(52/62)、89.47%(34/38)，PHH3分別為70.97%(44/62)、100.00%(38/38)；ASCUS/LSIL患者的HPV-L1陽(yáng)性表達(dá)率為69.05%，明顯高于ASC-H/HSIL(0)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論P(yáng)HH3、Ki67、p16聯(lián)合檢測(cè)可作為篩查宮頸脫落細(xì)胞的輔助手段，其能夠有效提高宮頸癌及癌前病變的診斷準(zhǔn)確性，檢測(cè)HPV-L1能夠?qū)SCUS/SLIL病變程度進(jìn)行有效分流，為臨床治療提供一定的指導(dǎo)。

宮頸脫落細(xì)胞；核分裂特異性抗體；人乳頭瘤病毒；宮頸癌

宮頸癌是臨床發(fā)病率較高的一種惡性腫瘤疾病，中國(guó)每年的宮頸癌新增病例數(shù)約占全球新增病例的29%，每年因?qū)m頸癌死亡的女性超過(guò)8萬(wàn)，嚴(yán)重危害著我國(guó)女性的生理健康及生命安全[1]。做好宮頸癌及癌前病變篩查，對(duì)于改善患者預(yù)后，提高患者生活質(zhì)量具有重大意義。近期不少文獻(xiàn)研究都顯示，人乳頭瘤病毒L1(HPV-L1)蛋白、腫瘤增殖抗原(Ki67)和抑癌基因(p16)、核分裂特異性抗體(PHH3)均與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系[2-3]。本研究旨在明確HPV-L1、Ki67、p16、PHH3表達(dá)在宮頸病變篩查中的臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料選取我院婦產(chǎn)科2015年4月至2016年4月期間收治的100例行宮頸脫落細(xì)胞液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查和雜交捕獲Ⅱ代法人乳頭瘤病毒(HPV HC-Ⅱ)檢測(cè)的患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡21～63歲，平均(36.8±4.6)歲；近12個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)激素藥物，未接受過(guò)宮頸治療；完成細(xì)胞學(xué)和HPV HC-Ⅱ檢測(cè)后行陰道鏡及宮頸活檢。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 細(xì)胞學(xué)及HPV HC-Ⅱ檢測(cè)(1)細(xì)胞學(xué)檢查：將宮頸刷插入患者陰道，在宮頸鱗柱交界順時(shí)針旋轉(zhuǎn)5圈后取出，將取得的宮頸脫落細(xì)胞放在保存液中。將取得的宮頸脫落細(xì)胞制作成液基薄層涂片，由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師閱片，根據(jù)TBS分類(lèi)法進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分級(jí)。(2)HPV HC-Ⅱ檢測(cè)：使用采樣刷在患者宮頸口順時(shí)針旋轉(zhuǎn)4圈后取出，將采集到的宮頸分泌物放入保存液中，送檢。采用HC-Ⅱ法進(jìn)行HR-HPV DNA檢測(cè)，檢測(cè)的DNA型別包括68、59、58、56、52、51、45、39、35、33、31、18、16。其中任意一種類(lèi)型的HR-HPV DNA結(jié)果為陽(yáng)性，即判定為HR-HPV DNA陽(yáng)性。

1.2.2 陰道鏡檢查和病理活檢陰道鏡檢查儀器使用顯微定影式光電一體陰道鏡，檢查過(guò)程中注意查看陰道壁情況，對(duì)異常部位進(jìn)行攝片。對(duì)陰道壁進(jìn)行碘染色，在不著色區(qū)取宮頸組織2～4塊，對(duì)于檢查未見(jiàn)異常者，分別在宮頸的3點(diǎn)、6點(diǎn)、9點(diǎn)、12點(diǎn)方向取宮頸組織，將取得的宮頸組織送病理科進(jìn)行病理活檢。對(duì)宮頸組織進(jìn)行石蠟包埋、切片，HE染色、閱片。

1.2.3 宮頸脫落細(xì)胞免疫組化檢查將取得的宮頸脫落細(xì)胞液體標(biāo)本離心后石蠟包埋、切片，采用Envision二步法進(jìn)行PHH3、Ki67、p16表達(dá)檢測(cè)。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對(duì)照，病理檢查為宮頸癌的標(biāo)本為陽(yáng)性對(duì)照。PHH3、Ki67、p16陽(yáng)性表達(dá)均位于細(xì)胞核，細(xì)胞核呈棕色顆粒染色判定為陽(yáng)性，無(wú)著色判定為陰性。

1.2.4 HPV-L1檢測(cè)HPV-L1試劑盒由美國(guó)愛(ài)迪旺斯公司提供，嚴(yán)格按照試劑盒上的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。HPV-L1陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞核，細(xì)胞核呈紅色染色判定為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分比(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸脫落細(xì)胞學(xué)診斷與宮頸組織學(xué)診斷宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢出未見(jiàn)上皮內(nèi)細(xì)胞病變(NILM)8例，非典型鱗狀上皮細(xì)胞/低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(ASCUS/LSIL)42例，鱗狀上皮內(nèi)病變/高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(ASC-H/HSIL)41例，SCC 9例，見(jiàn)表1。

表1 宮頸組織學(xué)與脫落細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果(例)

2.2 細(xì)胞學(xué)檢查與免疫標(biāo)記物表達(dá)ASCUS/ LSIL患者的Ki67、PHH3、p16陽(yáng)性檢出率均顯著低于ASC-H/HSIL患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=36.547、32.068、30.123，P均＜0.05)；ASC-H/HSIL與SCC患者的Ki67、PHH3、p16陽(yáng)性檢出率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.008，0.009及0.112，P＞0.05)，見(jiàn)表2。

表2 細(xì)胞學(xué)檢查與免疫標(biāo)記物表達(dá)比較[例(%)]

2.3 宮頸組織學(xué)診斷與免疫標(biāo)記物表達(dá)p16陽(yáng)性表達(dá)對(duì)宮頸癌及癌前病變的診斷敏感性、特異度分別為90.32%(56/62)、86.84%(33/38)，Ki67分別為83.87%(52/62)、89.47%(34/38)，PHH3分別為70.97% (44/62)、100.00%(38/38)，見(jiàn)表3。

表3 免疫標(biāo)記物表達(dá)與宮頸組織學(xué)診斷結(jié)果比較(例)

2.4 細(xì)胞學(xué)檢查與HPV-L1表達(dá)宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果異常的92例患者，HPV-DNA檢測(cè)結(jié)果均呈陽(yáng)性。其中ASCUS/LSIL患者的HPV-L1陽(yáng)性表達(dá)率為69.05%(29/42)，ASC-H/HSIL患者的HPV-L1陽(yáng)性表達(dá)率為19.51%(8/41)，SCC患者的HPV-L1陽(yáng)性表達(dá)率為0。ASCUS/LSIL患者的HPV-L1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于ASC-H/HSIL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 20.606，P＜0.05)。

3 討論

雜交捕獲Ⅱ代法人乳頭瘤病毒(HPV HC-Ⅱ)檢測(cè)與液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查是進(jìn)行宮頸病變篩查的常用手段，但因液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查的主觀性質(zhì)明顯，檢測(cè)結(jié)果多存在誤差。此外，HPV HC-Ⅱ檢測(cè)無(wú)法顯示病毒在細(xì)胞中存在的狀態(tài)，所以臨床還需尋找一些特異度和敏感度更高的標(biāo)志物，以提高宮頸病變篩查的準(zhǔn)確性[4]。

目前，已有研究證實(shí)宮頸癌的發(fā)生主要由HPV感染所致，HPV經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化發(fā)展，現(xiàn)已形成了多種類(lèi)型，按照致病性、功能及結(jié)構(gòu)的不同可將其分為高危型HPV和低危型HPV兩大類(lèi)[5]，而宮頸癌及癌前病變的發(fā)生是由高危型HPV持續(xù)感染引起的。HPV-L1蛋白是包裹在HPV DNA球心外層的主要衣殼蛋白，其作用為防止DNA受到核酸酶的破壞，保護(hù)病毒的致病活性。HPV-L1蛋白能夠識(shí)別并侵襲宿主細(xì)胞的特定部位，HPV附著在宿主細(xì)胞上以后，HPV-L1蛋白會(huì)協(xié)助病毒DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)部[6]。在HPV復(fù)制早期，HPV-L1呈陽(yáng)性表達(dá)，而在病毒DNA與宿主細(xì)胞DNA整合以后HPV-L1則呈陰性表達(dá)，所以檢測(cè)HPV-L1表達(dá)有助于判定HPV感染階段。本次研究結(jié)果顯示ASCUS/LSIL患者的HPV-L1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于ASC-H/HSIL(P＜0.05)。這一結(jié)果與洪玉鋒等[7]的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符，說(shuō)明HPV-L1陽(yáng)性表達(dá)可以作為HPV感染患者良惡性病變的鑒別手段，其能為臨床判定患者預(yù)后及轉(zhuǎn)歸效果提供可靠依據(jù)。p16基因是直接參與細(xì)胞周期調(diào)控功能的抑癌基因，其能對(duì)細(xì)胞有絲分裂進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)。p16在反應(yīng)性宮頸病變或正常宮頸細(xì)胞中呈陰性或微量表達(dá)，但其表達(dá)會(huì)隨著宮頸病變程度的加重而升高，可為宮頸癌惡性程度的判定提供依據(jù)[8]。PHH3是一種組蛋白H3抗體，具有抗磷酸化特性，其在正常的宮頸細(xì)胞中并不表達(dá)，只在發(fā)生病變的宮頸上皮細(xì)胞中表達(dá)。同時(shí)其表達(dá)水平還會(huì)隨著病變程度的加重而升高，其可作為核分裂標(biāo)記物對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行定量分析[9]。Ki67蛋白是只存在于細(xì)胞核內(nèi)的多克隆抗體，其與細(xì)胞有絲分裂有著密切聯(lián)系，G0期細(xì)胞無(wú)Ki67表達(dá)，只有G1、S、G2、M期細(xì)胞有Ki67表達(dá)，并且Ki67會(huì)在細(xì)胞有絲分裂后期降解，是臨床判定腫瘤細(xì)胞增殖活性的有效指標(biāo)[10]。本次研究結(jié)果顯示p16陽(yáng)性表達(dá)對(duì)宮頸癌及癌前病變的診斷敏感性、特異度分別為90.32%、86.84%，Ki67為83.87%、89.47%，PHH3分別為70.97%、100.00%。從研究結(jié)果可以看出Ki67、PHH3、p16對(duì)宮頸癌及癌前病變的診斷敏感性、特異度均較高，其中PHH3對(duì)宮頸癌的診斷特異度最高，提示進(jìn)行PHH3檢測(cè)能夠有效避免診斷結(jié)果的假陰性現(xiàn)象，提高診斷陽(yáng)性率。

綜上所述，PHH3、Ki67、p16對(duì)宮頸癌及癌前病變有較高的敏感性和特異性，三者聯(lián)合檢測(cè)可作為篩查宮頸脫落細(xì)胞有效的輔助手段，能夠提高宮頸癌及癌前病變的診斷準(zhǔn)確性，檢測(cè)HPV-L1能夠?qū)SCUS/SLIL病變程度進(jìn)行有效分流，為臨床治療提供一定的指導(dǎo)。

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Expression and clinical significance of p16,Ki67,PHH3 and HPV-L1 in exfoliated cervical cells.

HUANG Ping,ZHANG Xue,CHEN Guang-yuan,JIN Ying.Department of Gynecology,Songgang People's Hospital of Bao'an District of Shenzhen,Shenzhen 518105,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo observe the expression of p16 gene and Ki67 protein,mitosis-specific antibody anti-phosphohistone-H3(PHH3)and human papilloma virus(HPV)L1 protein(HPV-L1)gene in exfoliated cervical epithelial cells for cervical lesions,and to explore its clinical significance.MethodsA total of 100 patients of gynecological disease in Department of Gynecology from April 2015 to April 2016 were selected as research subjects. The exfoliated cervical cells were collected for high-risk HPV DNA detection by Hybrid CaptureⅡ(HPV HC-Ⅱdetection)and liquid-based cytology(LBC).The expression levels of HPV-L1,PHH3 Ki67 p16 were detected and analyzed.ResultsThere were negative for intraepithelial lesion or malignancy(NILM)in 8 cases,atypical squamous cells/low-grade squamous intraepithelial lesions(ASCUS/LSIL)in 42 cases,atypical squamous cells cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion/high-grade squamous intraepithelial lesions(ASC-H/HSIL)in 41 cases, and squamous cell carcinoma(SCC)in 9 cases.The positive rates of Ki67,PHH3 and p16 in ASCUS/LSIL patients were 19.05%,4.76%and 26.19%,respectively,which were significantly lower than those of ASC-H/HSIL patients(85.37%, 88.89%,88.89%),and the differences were statistically significant(P＜0.05).The diagnostic sensitivity and specificity for cervical cancer and precancerous lesions were 90.32%(56/62)and 86.84%(33/38)for p16,83.87%(52/62)and 89.47%(34/38)for Ki67,and 70.97%(44/62),100.00%(38/38)for PHH3.The positive expression rate of HPV-L1 in ASCUS/LSIL patients was 69.05%,significantly higher than that ofASC-H/HSIL patients(0),and the difference was statistically significant(P＜0.01).ConclusionPHH3,Ki67,p16 combined detection can serve as auxiliary screening means for exfoliated cervical cells,which can effectively improve the diagnostic accuracy of cervical cancer and precancerous lesions.Detection of HPV-L1 can divert the degree of pathological change of ASCUS/SLIL and provide some guidance for clinical treatment.

Exfoliated cervical cell;Mitosis-specific antibody;Human papillomavirus;Cervical cancer

R711.74

A

1003—6350（2016）21—3464—03

2016-04-23)

黃平。E-mail：youping77731@126.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.21.008