王娟，楊嵐，崔彬，王麗峰，文清華，徐蘭蘭，吳福清

（湛江廉江市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科1、檢驗(yàn)科2，廣東湛江524400）

HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA作為宮頸癌篩查分子標(biāo)記物的比較研究

王娟1，楊嵐1，崔彬1，王麗峰1，文清華1，徐蘭蘭1，吳福清2

（湛江廉江市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科1、檢驗(yàn)科2，廣東湛江524400）

目的探討人乳頭瘤病毒(HPV)DNA和HPV E6/E7 mRNA的兩種檢測(cè)標(biāo)記物在宮頸癌篩查中的應(yīng)用價(jià)值。方法選取2014年1月至2016年1月湛江廉江市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的406例宮頸癌患者為研究對(duì)象，采用超薄液基細(xì)胞學(xué)檢查(TCT)作為金標(biāo)準(zhǔn)。采用PCR法檢測(cè)所有患者的HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA，并評(píng)價(jià)兩種標(biāo)記物對(duì)宮頸癌診斷的敏感性和特異性。結(jié)果406例患者中HPV DNA陽(yáng)性率為47%(191/406)，而HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)陽(yáng)性率為31.2%(127/406)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；兩種檢測(cè)標(biāo)記物所得結(jié)果的符合率為85.5%；在CIN1標(biāo)本中，HPV DNA檢測(cè)的敏感度和特異度分別為88.6%、75.8%，與HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的86.9%、73.4%比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；在CIN2標(biāo)本中，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的特異性為90.5%，高于HPV DNA的79.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但是敏感性為83.9%，明顯低于HPV DNA的93.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；在CIN3標(biāo)本中，HPV mRNA檢測(cè)的敏感度和特異性分別為98.7%、85.9%，均高于HPV DNA的89.1%、78.8%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論檢測(cè)HPV mRNA在宮頸癌患者的診斷方面比檢測(cè)HPV DNA更具有優(yōu)勢(shì)。

人乳頭瘤病毒；E6/E7 mRNA；宮頸癌；篩查；分子標(biāo)記物

宮頸癌是婦產(chǎn)科常見(jiàn)的腫瘤疾病之一，隨著對(duì)宮頸癌早期篩查的開(kāi)展，其發(fā)病率和病死率得到明顯的改善[1]。然而，宮頸癌仍然是婦女發(fā)病和死亡的最常見(jiàn)惡性疾病[2]。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)屬于乳多空病毒科乳頭瘤空泡病毒A屬球形DNA病毒，其與宮頸癌有密切關(guān)聯(lián)，必須早期診斷及重視[3]。HPV最常見(jiàn)的基因型為HPV16、18、31、33和45[4]。在宮頸癌檢測(cè)中，宮頸涂片的細(xì)胞學(xué)檢測(cè)已得到廣泛的應(yīng)用，但是它并不是宮頸癌篩查的理想方法。隨著表觀遺傳學(xué)與精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，HPV病毒DNA檢測(cè)在宮頸癌篩查中已有較大的改善，但其陽(yáng)性預(yù)測(cè)率和特異性仍然偏低。研究表明HPV的感染是瞬時(shí)事件，通常不需要治療就可在6～24個(gè)月后自動(dòng)清除，因此可能出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果[5]。而在病毒表達(dá)方面，研究則認(rèn)為長(zhǎng)期反復(fù)感染與HPV E6/E7密切相關(guān)[6]。與HPV DNA的檢測(cè)不同，對(duì)病毒RNA的檢測(cè)可以檢測(cè)有轉(zhuǎn)錄活性的病毒。因此，作為受感染細(xì)胞中E6/E7癌基因持續(xù)表達(dá)的標(biāo)志，HPV E6/E7 mRNA可能成為有意義的腫瘤標(biāo)志物[7]，是目前宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要參考指標(biāo)之一[8]。本研究通過(guò)比較HPV DNA檢測(cè)與HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在宮頸癌患者中的特異性和敏感性，為宮頸癌的臨床篩查提供更有效的手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2014年1月至2016年1月湛江市廉江人民醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的406例重度宮頸炎患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：宮頸炎，分級(jí)為重度，伴見(jiàn)宮頸糜爛、接觸性出血、宮頸腫物等，尚未經(jīng)系統(tǒng)治療，知情同意取宮頸脫落細(xì)胞及宮頸活檢組織?；颊咂骄挲g(40.1±10.8)歲。按照Bethesda系統(tǒng)分類標(biāo)準(zhǔn)，其中正常為未見(jiàn)病變細(xì)胞(NILM，258例)，異常為非典型鱗狀細(xì)胞(ASCUS，26例)、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL，81例)、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL，41例)。以病理檢查報(bào)告為金標(biāo)準(zhǔn)，組織學(xué)采用Richart標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)：CIN1 (85例)、CIN2(267例)、CIN3(54例)，分別指輕、中、重度宮頸鱗狀上皮非典型增生。按照浸潤(rùn)情況分類，超過(guò)1/2的有283例，小于1/2的有123例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 臨床標(biāo)本收集所有患者行宮頸超薄液基細(xì)胞學(xué)檢查(thin prep liquid-based cytology test，TCT)，陰道鏡下活檢組織進(jìn)行病理學(xué)檢查。TCT取材采用活檢刷拭法，在宮頸管內(nèi)和鱗住上皮交界處采集細(xì)胞后刷洗在TCT保存液中。

1.2.2 RNA提取采用TRI裂解液(購(gòu)自Sigma公司)進(jìn)行常規(guī)裂解。使用微量移液器吹打使之裂解充分并混勻。加入氯仿200 μL，水平振蕩器勻速振蕩15 s。預(yù)冷離心機(jī)至4°C，待室溫平衡3 min后置于低溫高速離心機(jī)離心(Thermo公司)，條件為12 000 r/min，離心15 min。取400 μL水相并加入異丙醇500 μL，充分混勻；低溫高速離心機(jī)離心15 min，條件為12 000 r/min，棄上清；加入70%乙醇溶液1 000 μL洗滌；4°C，7 500 r/min，低溫高速離心機(jī)離心5 min，棄上清。沉淀風(fēng)干3～5 min后加入焦碳酸二乙酯處理水40 μL溶解RNA沉淀，測(cè)定RNA濃度和完整性，-70°C保存。

1.2.3 HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)按照說(shuō)明書進(jìn)行常規(guī)預(yù)處理，利用宮頸穩(wěn)態(tài)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)試，通過(guò)配套計(jì)算軟件自動(dòng)讀取HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)值。HPV RNA陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為檢測(cè)樣本的平均拷貝數(shù)值＞1.0。

1.2.4 HPV DNA檢測(cè)采用PCR反向點(diǎn)雜交法對(duì)人乳頭瘤病毒HPV基因分型進(jìn)行檢測(cè)(試劑盒購(gòu)自杭州美聯(lián)生物科技有限公司)。按照試劑盒說(shuō)明書對(duì)上述標(biāo)本進(jìn)行HPV檢測(cè)及基因分型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用獨(dú)立兩樣本t檢驗(yàn)(方差不齊采用校正t檢驗(yàn))，計(jì)數(shù)資料采用Pearsonχ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測(cè)標(biāo)記物陽(yáng)性率比較406例宮頸癌患者中191例HPV DNA檢測(cè)陽(yáng)性，占47.0%，127例HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)陽(yáng)性，占31.2%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。兩種標(biāo)記物檢測(cè)的總體符合率為85.5%，其中兩種標(biāo)記物檢測(cè)均呈陽(yáng)性者204例，均為陰性144例。有59例檢測(cè)結(jié)果不一致(14.5%)，見(jiàn)表1。在HPV DNA陽(yáng)性患者中，HPV mRNA陽(yáng)性的病理分型分布為NILM占19.6%，ASCUS占41.2%，LSIL占45.9%，HSIL占83.7%，結(jié)果見(jiàn)圖1。病理分級(jí)分布為CIN1占63.6%，CIN2占85.7%，CIN3占100%，見(jiàn)圖2。

表1 兩種檢測(cè)標(biāo)記物陽(yáng)性率較比(n=406)

2.2 兩種檢測(cè)標(biāo)記物的診斷符合率比較在CIN1標(biāo)本中，HPV DNA檢測(cè)的敏感度為88.6%，特異度75.8%，而HPV mRNA檢測(cè)的敏感度為86.9%，特異度為73.4%。在CIN2的標(biāo)本中HPV DNA檢測(cè)的敏感度為93.7%，特異度為79.8%，而HPV mRNA檢測(cè)的敏感度為83.9%，特異度為90.5%。在CIN3標(biāo)本中，HPV DNA檢測(cè)的敏感度為85.9%，特異度為78.8%，而HPV mRNA檢測(cè)的敏感度為98.7%，特異度為89.4%。兩種檢測(cè)標(biāo)記物對(duì)CIN1標(biāo)本檢測(cè)的敏感度與特異度比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.05，敏感度= 0.83；χ2=0.10，特異度=0.75)。在對(duì)CIN2標(biāo)本的檢測(cè)中，HPV mRNA檢測(cè)的特異度高于HPV DNA(χ2=4.89，P= 0.03)，而敏感度比HPV DNA稍差(χ2=4.74，P=0.03)。在對(duì)CIN3標(biāo)本的檢測(cè)中，HPV mRNA檢測(cè)的敏感度和特異性均高于對(duì)HPV DNA的檢測(cè)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.78，敏感度=0.00；χ2=4.39，特異度=0.04)。

圖1 HPV DNA陽(yáng)性患者中HPV mRNA陽(yáng)性的病理分型分布

圖2 HPV DNA陽(yáng)性患者中HPV mRNA陽(yáng)性的病理分級(jí)分布

3 討論

3.1 宮頸癌及目前臨床常用的篩查方法宮頸癌是一高發(fā)的婦科腫瘤,雖然在發(fā)達(dá)國(guó)家中已經(jīng)成功的降低了宮勁癌的死亡率，在其早期預(yù)防階段推行更加敏感和更加具體的方法學(xué)仍然存在著挑戰(zhàn)。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)研究表明，宮頸癌死亡率較高，每年約有50萬(wàn)的婦女因其去世，對(duì)家庭和社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的健康威脅。再者，人乳頭瘤病毒感染也被認(rèn)定為宮頸癌的主要病因之一，早期篩查有助于宮頸癌的防治與轉(zhuǎn)歸[9]。因此，臨床迫切需要新型特異性生物標(biāo)記物來(lái)實(shí)現(xiàn)診斷與干預(yù)。當(dāng)前HPV的分子診斷方法主要依賴于對(duì)HPV DNA標(biāo)記物檢測(cè)。有研究認(rèn)為，HPV DNA標(biāo)記物檢測(cè)是病因?qū)W依據(jù)，不能判斷出宮頸感染的具體階段以及癌基因的活性程度[10]。相對(duì)來(lái)說(shuō)，HPV E6/E7標(biāo)記物則可在宮頸癌組織中表現(xiàn)為癌基因活性，同時(shí)HPV E6/E7標(biāo)記物水平與病變的嚴(yán)重程度有關(guān)[11]。再者，研究還發(fā)現(xiàn)高危型HPV癌基因E6和E7對(duì)于惡性腫瘤的轉(zhuǎn)化和維持具有重要作用，因而檢測(cè)HPV E6和E7標(biāo)記物得到越來(lái)越多的關(guān)注。

目前，最常用的篩查方法包括宮頸刮片檢查?；谥貜?fù)的細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，將追蹤患者異常的細(xì)胞形態(tài)切片作為指標(biāo)，HPV DNA標(biāo)記物檢測(cè)以及陰道鏡檢測(cè)[1]。在篩查子宮頸癌中，細(xì)胞形態(tài)學(xué)的低敏感性以及HPV DNA標(biāo)記物檢測(cè)的特異性都需要提高，并且采用更加特異的方法進(jìn)行演算，而不是采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)和HPV DNA標(biāo)記物檢測(cè)，尤其對(duì)于年輕的群體(21～29歲)來(lái)說(shuō)，因?yàn)檫@一群體不建議采用HPV DNA檢測(cè)。對(duì)于區(qū)分暫時(shí)性和永久性感染，DNA檢測(cè)不足以提供信息。這種檢測(cè)標(biāo)記物賦予了全面診斷和全局治療暫時(shí)性感染的風(fēng)險(xiǎn)。檢測(cè)HPV原癌基因的活性而不是檢測(cè)HPV DNA的存在是一種更加相關(guān)的診斷宮頸癌病變以及宮頸癌的指標(biāo)。它能夠提供臨床上的預(yù)測(cè)標(biāo)志，以區(qū)分女性存在發(fā)展為高級(jí)別的宮頸不典型增生病變或者宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)。并且在評(píng)估女性輕微宮頸病變中，對(duì)于檢測(cè)HPV DNA的存在，檢測(cè)其活性可以用來(lái)作為更加特異的指標(biāo)。為了提高篩查的程序，建立更好的特異性，基于HPV mRNA的檢測(cè)方法學(xué)。

3.2 HPV DNA和E6/E7 mRNA檢測(cè)標(biāo)記物與宮頸病變程度HPV基因組中E6/E7基因是病毒原癌基因，病毒DNA一旦整合進(jìn)入宿主細(xì)胞DNA中，E6/E7基因?qū)⒉皇芸刂频馗叨缺磉_(dá)。E6/E7 mRNA表達(dá)是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的必經(jīng)步驟。隨著宮頸病變的加重，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陽(yáng)性率也隨之增加。張生枝等[10]的對(duì)CIN2宮頸病變患者的研究發(fā)現(xiàn)，HPV E6/ E7 mRNA特異度高于HPV DNA，通過(guò)ROC曲線分析，其準(zhǔn)確性也高于HPV DNA。但HPV DNA的靈敏度不夠高，導(dǎo)致漏診風(fēng)險(xiǎn)的存在。

3.3 兩種標(biāo)記物的敏感性和特異性本研究分別采用HPV DNA和E6/E7 mRNA檢測(cè)兩種標(biāo)記物對(duì)406例患者標(biāo)本進(jìn)行了比較研究。研究結(jié)果表明，HPV DNA檢測(cè)的陽(yáng)性率(47%)高于HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)(31.2%)。本研究采用組織病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。在CIN1分級(jí)標(biāo)本中，HPV DNA檢測(cè)的敏感度與特異度與HPV mRNA檢測(cè)的敏感度和特異性上沒(méi)有差異。在CIN2分級(jí)標(biāo)本的檢測(cè)中，HPV mRNA檢測(cè)的特異性高于HPV DNA檢測(cè)，但是敏感性比HPV DNA檢測(cè)低。在對(duì)CIN3分級(jí)標(biāo)本的檢測(cè)中，HPV mRNA檢測(cè)的敏感度和特異性都高于對(duì)HPV DNA的檢測(cè)。這與張生枝等[10]的研究結(jié)果相一致。上述研究結(jié)果表明，HPV mRNA檢測(cè)在對(duì)宮頸癌患者的診斷方面比HPV DNA檢測(cè)更具有優(yōu)勢(shì)，可以顯著減少假陰性結(jié)果。因此HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)在臨床上對(duì)宮頸病變的檢測(cè)與診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景，加之PCR技術(shù)日漸成熟，其具有檢測(cè)時(shí)間少，靶點(diǎn)精確和技術(shù)先進(jìn)的特點(diǎn)，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)未來(lái)可能成為宮頸癌篩查的重要輔助診斷指標(biāo)與手段。

[1]Carcopino X,Henry M,Olive D,et al.Detection and quantification of human papillomavirus genital infections:virological,epidemiological,and clinical applications[J].Med Mal Infect,2011,41(2):68-79.

[2]Ronco G,Dillner J,Elfstr?m KM,et al.Efficacy of HPV-based screening for prevention of invasive cervical cancer:Follow-up of four European randomised controlled trials[J].Lancet,2014,383 (9916):524-532.

[3]Andersson E,Karrberg C,Radberg T,et al.Type-dependent E6/E7 mRNA expression of single and multiple high-risk human papillomavirus infections in cervical neoplasia[J].J Clin Virol,2012,54(1): 61-65.

[4]Ratnam S,Coutlee F,Fontaine D,et al.Clinical performance of the Pre Tect HPV-Proofer E6/E7 mRNA assay in comparison with that of the Hybrid Capture 2 test for identification of women at risk of cervical cancer[J].J Clin Microbiol,2010,48(8):2779-2785.

[5]Verdoodt F,Szarewski A,Halfon P,et al.Triage of women with minor abnormal cervical cytology:Meta analysis of the accuracy of an assay targeting messenger ribonucleic acid of 5 high-risk human papillomavirus types[J].Cancer Cytopathol,2013,121(12):675-687.

[6]Shen Y,Gong J,He Y,et al.Quntivirus HPV E6/E7 RNA 3.0 assay (Bdna)is as sensitive,but less specific than Hybrid caputure 2 test [J].J VirolMethods,2013,187(2):288-293.

[7]Pietrzak B,Mazanowska N,Ekiel AM,et al.Prevalence of high-risk human papillomavirus cervical infection in female kidney graft recipients:an observational study[J].Virol J,2012,9:117.

[8]杜彩英,李芳.人乳頭瘤病毒DNA及E6/E7 mRNA檢測(cè)在宮頸病變?cè)\斷中的比較研究[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,2015,23(4):38-40.

[9]Argyri E,Tsimplaki E,et al.E6/E7 mRNA expression of high-risk HPV types in 849 greek women[J].Anticancer Res,2013,33(9): 4007-4011.

[10]張生枝,邵華江,馬建婷.人乳頭瘤病毒E6/E7 mRNA檢測(cè)在宮頸病變篩查中的應(yīng)用價(jià)值[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2014,18(4):582-585.

[11]黃寶英,周倫順,富顯果,等.HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)宮頸癌篩查意義的初步評(píng)價(jià)[J].中華腫瘤防治雜志,2013,7(14):1061-1064.

Comparative study of HPV E6/E7 mRNA and HPV DNA biomarker in the diagnosis of cervical carcinoma.

WANG Juan1,YANG Lan1,CUI Bing1,WANG Li-feng1,WEN Qing-hua1,XU Lan-lan1,WU Fu-qing2.Department of Obstetrics and Gynecology1,Department of Laboratory2,the People's Hospital of Lianjiang City,Zhanjiang 524400,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the application value of two biomarkers of HPV E6/E7 mRNA and HPV DNA in the screening diagnosis of cervical carcinoma.MethodsA total of 406 patients with cervical carcinoma, who admitted to Department of Obstetrics and Gynecology of the People's Hospital of Lianjiang City from January 2014 to January 2016,were selected as the research objects.Human papillomavirus(HPV)E6/E7 mRNA and HPV DNA were detected by polymerase chain reaction(PCR)in all patients,and the sensitivity and specificity of the two markers for cervical intraepithelial neoplasia diagnosis were evaluated and compared by ThinPrep liquid based cytology(TCT).ResultsThe positive rate of HPV DNA and E6/E7 mRNA test were 47%(191/406)and 31.2%(127/406), respectively(P＜0.05).The overall coincidence rate of the two markers was 85.5%.There were no significant difference between HPV DNA and E6/E7 mRNA test in sensitivity and specificity for detecting CIN1(88.6%vs 86.9%,75.8%vs 73.4%,P＞0.05).There were significant differences between HPV DNA and E6/E7 mRNA test in sensitivity and specificity for detecting CIN2(93.7%vs 83.9%,P＜0.05;79.8%vs 93.7%,P＜0.05).The sensitivity and specificity of HPV E6/E7 mRNA assay(98.7%,85.9%,respectively)were significantly higher than those of HPV DNA test(89.1%,78.8%,respectively)for detecting CIN3(P＜0.05).ConclusionIn the screening diagnosis of HPV of cervical carcinoma,HPV E6/E7 mRNAtest has significantly higher specificity and sensitivity than HPV DNAtest.

Human papillomavirus(HPV);E6/E7 mRNA;Cervical carcinoma;Screening,Biomarker

R737.33

A

1003—6350（2016）21—3458—04

2016-05-25)

廣東省湛江市非資助科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2014B101)

王娟。E-mail：13610188703@qq.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.21.006