張煜炯， 彭 昕，*， 吉慶勇， 郭巧生（.浙江醫(yī)藥高等?？茖W校，浙江寧波500；.南京農(nóng)業(yè)大學中藥材研究所，江蘇南京0095；.麗水市綠谷三葉青珍稀植物研究所，浙江麗水000）

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聚類分析和主成分分析法研究三葉青氯仿部位HPLC指紋圖譜

張煜炯1， 彭 昕1，2*， 吉慶勇3， 郭巧生2
（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W校，浙江寧波315100；2.南京農(nóng)業(yè)大學中藥材研究所，江蘇南京210095；3.麗水市綠谷三葉青珍稀植物研究所，浙江麗水323000）

摘要：目的 建立不同產(chǎn)地三葉青藥材氯仿部位的HPLC指紋圖譜，并進行聚類分析和主成分分析。方法 分析采用Agi1ent C18色譜柱；以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃；檢測波長210 nm。結(jié)果 17批三葉青樣品的HPLC指紋圖譜中有15個共有峰，其中3個峰被確認為槲皮素、山萘酚-3-O-新橙皮糖苷和β-谷甾醇。結(jié)論 樣品產(chǎn)地可被聚成5類，并且4個主成分的累計方差貢獻率為85.38%。

關(guān)鍵詞：三葉青；氯仿部位；HPLC指紋圖譜；聚類分析；主成分分析

The ana1ysiswas performed on Agi1ent C18co1umn，mobi1e phase was acetonitri1e-0.1% phosphoric acid aqueous so1ution with gradient e1ution，f1ow ratewas1.0 mL/min，co1umn temperaturewasmaintained at30℃，and detection wave1ength was setat210 nm.RESULTS Therewere fifteen common peaks in the HPLC fingerprints of seventeen batches of Tetrastigma hemsleyanum samp1es，three ofwhich were identified as quercetin，kaempfero1-3-O-rutinoside and β-sitostero1.C0NCLUSI0N The growing areas of samp1es can be c1assified into five groups，and four principa1 componentsmake up 85.38% of the tota1variance.

KEY W 0RDS：Tetrastlgma hemsleyanum Die1s et Gi1g；ch1oroform extract；HPLC fingerprint；c1uster ana1ysis；principa1 component ana1ysis

三葉青Tetrastlgma hemsleyanum Die1s et Gi1g又名有角烏蘞莓、石老鼠、金線吊葫蘆等，為葡萄科崖爬藤屬植物，，可治療高熱、肝炎、風濕性關(guān)節(jié)炎及病毒性腦膜炎等多種疾?。?-2］，也是抗腫瘤常用藥物［3-4］，含黃酮、有機酸和花青素類等多種活性成分［5］，其塊根中分離并鑒定出的化合物有β-谷甾醇、胡蘿卜苷、山萘酚-3-O-新橙皮糖苷等［6］，為三葉青中重要的藥效成分［7-8］。本課題組前期從中篩選出抗肝癌細胞毒活性最強的為氯仿提取部分，呈劑量依賴性地誘導肝癌HepG2細胞，呈現(xiàn)典型的凋亡特征性改變，并可改變其細胞周期分布，發(fā)生S期阻滯［9］。

大量研究表明，不同產(chǎn)區(qū)、品種三葉青有效成分的含有量及藥理活性差異懸殊，如不同產(chǎn)地野生及栽培三葉青中總黃酮含有量相差最多7倍［10］，而個別產(chǎn)區(qū)幾乎檢測不到［11］，嚴重影響了臨床療效，故建立三葉青藥材質(zhì)量評價體系，以確保其臨床應用顯得極為迫切。目前，有關(guān)對三葉青藥理作用和藥材質(zhì)量的報道僅以總黃酮或其中幾個黃酮成分的定量分析為參考指標［12］，難以全面反映和區(qū)分該藥材的整體質(zhì)量。近年來，HPLC指紋圖譜以其快速準確的特點，被廣泛應用于中藥生產(chǎn)、質(zhì)量控制等方面［13］，其反映的化學成分，包括中藥有效部位及種類，成為控制中藥材質(zhì)量的可靠技術(shù)，文獻［14］對三葉青HPLC指紋圖譜進行了初步探索，但其取樣僅局限于浙江產(chǎn)區(qū)，而且未對共有化學特征峰等進行統(tǒng)計學分析，信息非常有限。為更全面地控制三葉青藥材的質(zhì)量，本實驗建立了以其氯仿活性部位為基礎(chǔ)的HPLC指紋圖譜，測定17個不同產(chǎn)地的藥材，并結(jié)合聚類分析和主成分分析［15］，對其模式進行識別研究，可為更全面評價該部位活性物質(zhì)的質(zhì)量提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Dionex U1timate 3000高效液相色譜儀，包括四元泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器；XS105DU電子分析天平（瑞士Mett-1er-To1edo公司）；6202高速粉碎機（臺灣欣鎮(zhèn)企業(yè)有限公司）；LABOIOTA 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heido1ph公司）；Mi11ipore Simp1icity超純水機（美國Pa11公司）；SB-5200D超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）。

1.2 藥材 三葉青藥材由浙江省麗水市綠谷三葉青珍稀植物研究所提供，并經(jīng)吉慶勇高級農(nóng)藝師鑒定為三葉青Tetrastlgma hemsleyanum Die1s et Gi1g的塊莖，樣本保存于麗水市綠谷三葉青珍稀植物研究所，具體信息見表1。

1.3 試劑 乙腈（美國TEDIA公司）、甲醇（天津四友精細化學品公司）為色譜純；氯仿、磷酸、95%乙醇為分析純；水為超純水。β-谷甾醇（批號ZN1113BA14）、山萘酚-3-O-新橙皮糖苷（批號IF0228FA14）、槲皮素（批號TP60448FC23）對照品，均購自上海源葉生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agi1ent C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，20% A； 10～40 min，20～80% A；40～80 min，80～95% A）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃；檢測波長210 nm；進樣量20 μL。

表1 三葉青藥材信息及相似度Tab.1 Information and sim ilarities of T.hemsleyanum samples

2.2 供試品溶液制備 藥材除去雜質(zhì)，自然晾干，高速粉碎過60目篩，精密稱取3.0 g，置于250 mL圓底燒瓶中，精密加入95%乙醇70 mL，超聲30 min（250 W、40 KHz），80℃水浴回流提取1.0 h，過濾，重復3次，合并濾液，濃縮揮干。加20 mL水超聲溶解，100 mL石油醚（60～90℃）萃取1次，棄去石油醚部分，再用50 mL氯仿萃取3次，合并氯仿部分，濃縮揮干。甲醇定容于5 mL量瓶中，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。2.3 對照品溶液制備 精密稱取β-谷甾醇3.06 mg、山萘酚-3-O-新橙皮糖苷2.95 mg、槲皮素2.42 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，超聲，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取湖北恩施產(chǎn)地（S7）三葉青藥材，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣6次，以第6次進樣所得指紋圖譜為對照，導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004年A版），計算相似度。結(jié)果，相似度均不小于0.98，符合指紋圖譜相關(guān)要求（不小于0.95）［16］，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取湖北恩施產(chǎn)地（S7）三葉青藥材，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件于0、2、4、8、12、24 h檢測指紋圖譜，以第8 h進樣所得指紋圖譜為對照，導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004年A版），計算相似度。結(jié)果，相似度均不小于0.98，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復性試驗 取湖北恩施產(chǎn)地（S7）三葉青藥材，按“2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，在“2.1”項色譜條件檢測指紋圖譜，以第1次進樣所得指紋圖譜為對照，導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004年A版），計算相似度。結(jié)果，相似度均不小于0.98，表明該方法重復性良好。

2.5 指紋圖譜的建立與技術(shù)參數(shù)

2.5.1 指紋圖譜的建立 將17批三葉青藥材按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進行測定，記錄各產(chǎn)地三葉青的HPLC圖。以AIA（*cdf）格式導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004年A版），設定樣品S10色譜圖為參照圖譜，對保留時間的色譜峰進行多點校正，自動匹配，時間寬度為0.1 min，經(jīng)系統(tǒng)自動匹配，生成對照指紋圖譜I，并建立17批次三葉青氯仿部位的指紋圖譜，見圖1。

圖1 17批三葉青藥材氯仿部位指紋圖譜Fig.1 Fingerprints of the chloroform extract of 17 batches of T.hemsleyanum sam ples

2.5.2 共有峰的標定 根據(jù)17批次三葉青指紋圖譜的檢測結(jié)果，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004年A版）的數(shù)據(jù)匹配功能，在對照指紋圖譜上標定15個共有指紋峰（占總峰面積90%以上），見圖2（A）。通過進樣混合對照品，發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇、山萘酚-3-O-新橙皮糖苷、槲皮素在各產(chǎn)地樣品圖譜中均有發(fā)現(xiàn)，保留時間均一致，故確定2號峰為槲皮素，3號峰為山萘酚-3-O-新橙皮糖苷，15號峰為β-谷甾醇，見圖2（B）。其中，4號峰分離度良好，保留時間適宜，故選為參照峰，而且各共有峰較穩(wěn)定，具有指紋圖譜特征，故擬定為三葉青藥材氯仿活性部位的活性成分群。各產(chǎn)地藥材的共有峰保留時間與相對峰面積見表2。

圖2 樣品和混合對照品的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram s of sam ples and m ixed reference substances

2.5.3 相似度評價 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004年A版），計算17批三葉青藥材氯仿活性部位HPLC指紋圖譜的相似度，以生成的共有模式為對照，相似度在0.816～0.985之間，表明各產(chǎn)地藥材氯仿部位均有良好的相似性。

2.5.4 三葉青藥材聚類分析 以不同產(chǎn)地三葉青藥材的15個共有峰峰面積為原始數(shù)據(jù)，SPSS19.0軟件對藥材進行系統(tǒng)聚類分析，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)，以夾角余弦為樣品相似度的距離公式，聚類分析結(jié)果見圖3。由圖可知，三葉青藥材被分為5大類，Ⅰ類包括S3、S11、S12、S15；Ⅱ類包括S2、S10；Ⅲ類包括S4、S14；Ⅳ類包括S5、S6、S7、S13、S9、S8、S16、S17；V類包括S1。以各共有峰為變量，得到指紋圖譜得分圖，可見5類樣品緊密地聚集在一起，而且各自分散在不同區(qū)域（圖4），使不同產(chǎn)地三葉青藥材之間得到了一定區(qū)分。同時，通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，各產(chǎn)地三葉青藥材之間的相關(guān)性與相似度分析結(jié)果較為一致。

2.5.5 三葉青藥材共有峰主成分分析 主成分分析法是一種應用廣泛的多元統(tǒng)計方法，用于簡化數(shù)據(jù)，快速實現(xiàn)模式或關(guān)系的可視化識別［17］。SPSS 19.0軟件對原始數(shù)據(jù)進行標準化處理，以主成分的特征值及貢獻率為依據(jù)，對17個不同產(chǎn)地三葉青藥材的15個共有峰（變量）進行主成分分析，結(jié)果見表3。

表2 共有峰的相對峰面積Tab.2 Relative peak areas of common peaks

圖3 聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram of cluster analysis

圖4 HPLC指紋圖譜得分圖Fig.4 Score p lots of HPLC fingerprint

表3 特征值表Tab.3 Table of characteristic values

由表可知，主成分個數(shù)的提取原則為其對應的特征值大于1，故取前4個（A1～A4）作為主成分，其累計貢獻率達到85.38%。其中，第一主成分特征值為5.897，貢獻率為39.311%；第二主成分特征值為3.321，貢獻率為22.138%；第三主成分特征值為2.009，貢獻率為13.394%；第四主成分特征值為1.581，貢獻率為10.537%。

旋轉(zhuǎn)后的公共因子載荷矩陣見表4，可知每個載荷量表示主成分與對應變量的相關(guān)系數(shù)。4個主成分與15個共有峰指標的線性組合模型如下，計算綜合得分。

表4 旋轉(zhuǎn)后的公共因子載荷矩陣表Tab.4 Load matrixes of postrotational common factors

A1＝-0.019 8P1-0.011 5P2-0.004P3＋0.010 3P4-0.031P5＋0.080 7P6＋0.061 0P7＋0.035 8P8-0.002 9P9＋0.075 8P10-0.041 6P11＋0.081 5P12＋0.185 0P13＋0.057 7P14-0.009 1P15

A2＝0.137 7P1-0.007 7P2＋0.148 2P3-0.016 5P4＋0.015 4P5-0.011 0P6-0.018 7P7＋0.040 1P8＋0.124 6P9-0.007 7P10-0.003 3P11-0.011 5P12-0.007 1P13-0.035 1P14＋0.084 5P15

A3＝0.014 8P1＋0.036 0P2＋0.010 6P3-0.043 7P4＋0.273 0P5-0.072 0P6＋0.065 6P7＋0.139 0P8＋-0.030 3P9-0.040 2P10＋0.319 6P11-0.086 8P12-0.077 6P13＋0.071 3P14-0.032 5P15

A4＝0.054 1P1-0.016 7P2-0.014 3P3＋0.410 4P4-0.109 8P5-0.060 4P6＋0.161 4P7＋0.007 2P8-0.222 7P9＋0.112 9P10-0.005 6P11-0.112 1P12-0.151 9P13＋0.153 5P14＋0.241 8P15

以第一、第二主成分為變量，得到二維投影圖，見圖5。以X軸為例，在投影圖中選取距離原點較遠的幾個點，得到第一主成分中變量的權(quán)重值，權(quán)重值越大，該化合物在三葉青藥材中的作用越大。其中，前5名變量的權(quán)重值分別為0.940、0.934、0.911、0.891、0.851，對應6、12、10、13和7號峰。從對照品色譜圖可知，此5個峰為未知成分，需要進一步的分析確認。

3 討論與分析

圖5 HPLC指紋圖譜的二維投影圖Fig.5 2D projection map of HPLC fingerprint

3.1 實驗條件的優(yōu)化 本實驗考察了超聲提取、冷浸提取、加熱回流以及超聲加熱回流4種提取方式，同時比較了60%、80%和95%乙醇的提取溶劑，發(fā)現(xiàn)以95%乙醇為提取溶劑，超聲加熱回流提取的效果最佳。再對甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-水和乙腈-0.1%磷酸水溶液4組流動相系統(tǒng)進行篩選，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%水溶液的梯度洗脫效果最佳，得到的色譜峰最多，峰型和分離度較好，基線平穩(wěn)。在氯仿萃取之前，先用100 mL石油醚萃取1次，可有效去除三葉青醇提物中色素的干擾。同時，為盡可能多得到可供分析的色譜峰，應用紫外光譜對樣品進行190～400 nm的全波長掃描，發(fā)現(xiàn)200～230 nm波段處有較大吸收，結(jié)合DAD檢測器，對200、210、218、230 nm的波長進行考察，發(fā)現(xiàn)在210 nm處色譜峰信息較多，基線較平穩(wěn)，色譜峰響應值相當。因此，選擇檢測波長為210 nm。

3.2 指紋圖譜結(jié)果差異分析 建立全面、系統(tǒng)、特征性的指紋圖譜，是三葉青質(zhì)量評價的有效辦法。通過建立17個不同產(chǎn)地三葉青氯仿部位HPLC指紋圖譜，確定15個共有峰，以共有模式為對照，相似度在0.816～0.985之間，表現(xiàn)出良好的相似性，各色譜峰相對保留時間基本一致，符合指紋圖譜要求，所含化學成分基本相同。但由表2可知，各成分的色譜峰有較大差異，說明有效成分含有量差別較大，各產(chǎn)地三葉青藥材因品種資源、生態(tài)環(huán)境、生長年限、地域性等條件，均可能影響藥材的品質(zhì)，這為該藥材的質(zhì)量控制提供了參考。

3.3 聚類分析和主成分結(jié)果分析 由于相似度計算無法準確鑒定三葉青藥材的產(chǎn)地來源，同時考慮各共有峰之間的差異，本實驗再通過聚類分析和主成分進行統(tǒng)計學分析。其中，聚類分析能將不同基源的三葉青藥材進行分類鑒定，結(jié)果分為5大類，如寧波鄞州、麗水蓮都、遂昌和慶元產(chǎn)地的三葉青藥材聚在一起，說明這4個產(chǎn)地三葉青的品種、生長環(huán)境、生長年限相當，同時其指紋圖譜相似度接近。而且，它與相似度分析結(jié)果較為一致，得到了相互驗證。

利用主成分分析，得到了4個主成分，累計方差貢獻率為85.38%，說明這4個主成分可表達全部三葉青藥材化學成分的85.38%，只有14.62%的信息丟失。其中，第一主成分方差貢獻率最大，為39.31%，是三葉青藥材最重要的成分群，它所包含的化學成分基本反映出各產(chǎn)地三葉青藥材化學成分之間的相似性。另外，由于藥材受生長環(huán)境、種質(zhì)資源、經(jīng)緯度等各因素的影響，其質(zhì)量存在較大的差異，反映在色譜圖上，就是在同一保留時間處有不同的峰面積。主成分分析能篩選出共有的特征成分，并指導發(fā)現(xiàn)決定性作用的化學成分，但本實驗篩選出的特征成分未知，故需要結(jié)合質(zhì)譜等手段作進一步確定。綜上所述，運用聚類分析和主成分分析，可實現(xiàn)快速分析，發(fā)揮各自優(yōu)勢，互相驗證和補充，多角度綜合評判三葉青藥材的質(zhì)量。

4 結(jié)論

有關(guān)三葉青藥材的指紋圖譜研究較少，本實驗建立了不同產(chǎn)地三葉青藥材氯仿活性部位的HPLC指紋圖譜，并對其化學模式進行識別。結(jié)果，樣品的出峰數(shù)目、分離度均較理想，并標定出15個共有峰，對其中3個峰進行了確認，通過相似度計算、聚類分析和主成分分析，對藥材進行綜合評價，得到較理想的結(jié)果。同時，進行了HPLC方法學考察，發(fā)現(xiàn)精密度、穩(wěn)定性、重復性都符合指紋圖譜的要求，為三葉青藥材的質(zhì)量控制提供了更全面的參考。今后，本課題組將通過譜效學實驗，進一步尋找三葉青藥材“化學譜-藥效”之間的對應關(guān)系，確定其質(zhì)量控制的關(guān)鍵成分，構(gòu)建三葉青抗腫瘤譜-效關(guān)系方程及生物活性指紋圖譜。

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HPLC fingerprint of the chloroform extract of Tetrastigma hemsleyanum by cluster analysis and principal com ponent analysis

ZHANG Yu-jiong1， PENG Xin1，2 *， JIQing-yong3， GUO Qiao-sheng2

（I.ZheJiang Pharmaceutical College，Ningbo 3I5IOO，China；2.Department of Chinese Medicinal Materials，NanJing Agricultural University，Nan-Jing 2IOO95，China；3.Lishui Institute of Tetrastigma Hemsleyanum，Lishui323OOO，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish the HPLC fingerprint of ch1oroform extract of Tetrastigma hemsleyanum Die1s et Gi1g from different growing areas and to make c1uster ana1ysis and principa1 component ana1ysis.METH 0DS

*通信作者：彭 昕（1980—），女，碩士，副教授，研究方向為分子生物學。E-mai1：px4142@163.com

作者簡介：張煜炯（1982—），男，碩士，實驗師，研究方向為中藥材質(zhì)量控制。Te1：15958298818，E-mai1：sshhjj23@163.com

基金項目：浙江省中醫(yī)藥科技計劃A類項目（2013ZA119）；浙江省教育廳科研項目（Y201432548）；浙江省新苗人才計劃項目（2013I 433007）；浙江醫(yī)藥高等專科學校校級課題（ZPCSI 2014005）

收稿日期：2015-08-30

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.028

中圖分類號：I284.1

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）03-0607-06