張壯麗， 趙 寧， 王亞飛， 趙志鴻， 張小俊， 王桂芳（.河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院藥化科，河南鄭州45005；.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州45000）

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魚腥草揮發(fā)油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備與評(píng)價(jià)

張壯麗1， 趙 寧2 *， 王亞飛2， 趙志鴻1， 張小俊1， 王桂芳1
（1.河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院藥化科，河南鄭州450052；2.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州450001）

摘要：目的 制備并評(píng)價(jià)魚腥草揮發(fā)油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。方法 采用熔融乳化-超聲分散法，在單因素考察的基礎(chǔ)上利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化了制劑處方及制備工藝。采用氣相色譜法，建立了納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中魚腥草揮發(fā)油的定量測(cè)定方法，并從外觀、形態(tài)、粒徑分布、包封率、載藥量及短期穩(wěn)定性等方面對(duì)制劑進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果 最佳處方為單硬脂酸甘油酯0.12 g，辛酸癸酸三甘油酯0.08 g，泊洛沙姆188 0.533 g，蛋黃卵磷脂0.267 g，魚腥草揮發(fā)油0.1 g，重蒸餾水加至20 mL；最佳工藝為初乳攪拌20 min，超聲分散10 min，超聲振幅100%。所制備的納米粒平均粒徑約為（70.76±1.74）nm，Zeta電位為（-25.40±1.08）mV，包封率90.33%，載藥量5.76%。結(jié)論 所制備的魚腥草揮發(fā)油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑小，包封率高，物理穩(wěn)定性較好。

關(guān)鍵詞：魚腥草；揮發(fā)油；納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體；熔融乳化-超濾離心；氣相色譜（GC）

Preparation and evaluation of nanostructured lipid carrier loaded With volatileoil from Houttuynia cordatu Thunb.

ZHANG Zhuang-1i1， ZHAO Ning2 *， WANG Ya-fei2， ZHAO Zhi-hong1， ZHANG Xiao-jun1，WANG Gui-fang1
（I.Department of Medicinal Chemistry，Henan Provincial Academy of Medical Sciences，Zhengzhou 45OO52，China；2.College of Pharmaceutical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 45OOOI，China）

KEY W 0RDS：Houttuynia cordatu Thunb.；vo1ati1e oi1；nanostructured 1ipid carrier；me1ting emu1sification and centrifuga1u1trafi1tration；gas chromatography（GC）

魚腥草揮發(fā)油是魚腥草Houttuynia cordatu Thunb.的主要活性部位［1］，具有抗病毒、抗菌、抗炎、提高機(jī)體免疫力、抗過(guò)敏、抗腫瘤等藥理作用［2-8］，目前臨床應(yīng)用于消炎抗菌。中藥揮發(fā)油溶解性差、易揮發(fā)、性質(zhì)不穩(wěn)定，直接使用時(shí)生物利用度低，刺激性大，藥效不穩(wěn)定。若將納米制劑技術(shù)應(yīng)用于中藥揮發(fā)油，不僅能提高藥物的穩(wěn)定性和生物利用度，加強(qiáng)靶向及緩釋作用，還可減少不良反應(yīng)，開發(fā)出順應(yīng)性更好的給藥途徑的藥物［9］。

本實(shí)驗(yàn)采用熔融乳化-超聲分散法制備魚腥草揮發(fā)油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，以納米粒粒徑及Zeta電位為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素考察的基礎(chǔ)上利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化了制劑處方及制備工藝。采用氣相色譜法，建立了納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中魚腥草揮發(fā)油的定量測(cè)定方法，并從外觀、形態(tài)、粒徑分布、包封率、載藥量及穩(wěn)定性等方面對(duì)制劑進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與儀器

1.1 主要材料 魚腥草揮發(fā)油（原藥材購(gòu)自四川江油，由河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院董成明教授鑒定。將魚腥草干燥粉碎后，稱取100 g，裝入2 000 mL圓底燒瓶中，加10倍量蒸餾水，混勻并浸泡10 h后，水蒸氣蒸餾提取，回流10 h，收集淺黃色揮發(fā)油，精密稱定質(zhì)量，4℃下封裝保存?zhèn)溆茫?。單硬脂酸甘油酯（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；山崳酸甘油酯（法國(guó)嘉法獅公司）；辛酸/癸酸甘油三酯、泊洛沙姆188（德國(guó)巴斯夫股份公司）；蛋黃卵磷脂（上海艾偉特醫(yī)藥科技有限公司）。甲基正壬酮對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）

1.2 主要儀器 7890A氣相色譜儀、Hp-5MS毛細(xì)管色譜柱（美國(guó)安捷倫公司）；JEM-2100透射電鏡（日本電子株式會(huì)社）；ZS90納米粒度及Zeta電位分析儀（馬爾文儀器中國(guó)有限公司）；VCX130超聲細(xì)胞破碎儀（美國(guó)Sonics公司）；YIT-3熔點(diǎn)儀（天津大學(xué)精密儀器廠）；超濾離心管（100 kDa，密理博中國(guó)有限公司）

2 方法

2.1 甲基正壬酮測(cè)定方法 目前，魚腥草揮發(fā)油的測(cè)定主要以含有量高、性質(zhì)比較穩(wěn)定的甲基正壬酮為定量指標(biāo)［10］。

2.1.1 樣品溶液制備 精密量取納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體1 mL，置于10 mL量瓶中，加水定容，移取4 mL，置于25 mL圓底燒瓶中，加正己烷5 mL，密封，室溫水浴超聲萃取20 min，靜置，取正己烷層。再加正己烷5 mL，超聲萃取10 min，收集合并正己烷層，定容至10 mL，0.22 μm濾膜過(guò)濾，即得。

2.1.2 色譜條件 采用氣相色譜法，檢測(cè)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中揮發(fā)油含有量。HP-5MS石英毛細(xì)管色譜柱；載氣為氦氣；尾吹氣為氮?dú)?；進(jìn)樣口、氫火焰離子化檢測(cè)器溫度280℃；空氣體積流量450 mL/min；H2體積流量40 mL/min；柱體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；分流比20∶1；程序升溫（70℃保持5 min，5℃/min升至100℃，2℃/min升至123℃，保持3 min，30℃/min升至280℃，保持10 min）。

2.1.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取空白制劑和載藥制劑，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法處理樣品，并制備甲基正壬酮對(duì)照品溶液。3種樣品溶液在“2.1.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。

2.1.4 精密度考察 分別制備高、中、低質(zhì)量濃度甲基正壬酮溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定日內(nèi)精密度，連續(xù)5 d；每天進(jìn)樣1次，測(cè)定日間精密度。2.1.5 檢測(cè)限及定量限 配制系列質(zhì)量濃度的甲基正壬酮溶液，在“2.1.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，分別計(jì)算不同濃度樣品溶液色譜峰的信噪比（S/N）。S/N為10∶1時(shí)的樣品質(zhì)量濃度為定量限，而3∶1時(shí)的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限。

2.1.6 加樣回收率 精密量取相當(dāng)于處方量80%、100%、120%的甲基正壬酮溶液，加入到揮發(fā)油含有量已知的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體中，平行3份，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，在“2.1.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算回收率。

2.1.7 線性關(guān)系考察 配制甲基正壬酮對(duì)照品母液（1.640 4 mg/mL），按比例稀釋成系列質(zhì)量濃度（4.986 8、9.973 63、16.010 3、20.012 9、24.999 70、50.032 2、100.064 4、149.932 6、199.964 8、249.997 0、350.061 4、399.929 5 μg/mL）溶液，在“2.1.2”色譜條件下進(jìn)樣，記錄峰面積。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸分析。

2.2 魚腥草揮發(fā)油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備

2.2.1 熔融乳化-超聲分散法 將表面活性劑加適量重蒸餾水超聲溶解，作為水相；固/液脂質(zhì)水浴熔融后加入處方量的揮發(fā)油混勻，作為油相，電磁攪拌下將水浴等溫的水相緩慢加到油相中攪拌，形成初乳，然后超聲分散，冷水浴冷卻固化，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，加水定容至設(shè)定處方量，即得魚腥草揮發(fā)油-納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的膠體分散體系。

2.2.2 空白納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制備工藝影響因素考察 預(yù)設(shè)定處方為單硬脂酸甘油酯0.32 g，辛酸/癸酸三甘油酯0.08 g，蛋黃卵磷脂0.2 g，泊洛沙姆188 0.2 g，加重蒸餾水至20 mL，進(jìn)行制備工藝考察。

2.2.2.1 制備溫度 熔點(diǎn)測(cè)定儀測(cè)定固體脂質(zhì)及固/液脂質(zhì)混合物的熔點(diǎn)，用于確定制備溫度。

2.2.2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用“2.2.2.1”項(xiàng)下方法篩選出的制備溫度，選擇攪拌時(shí)間、超聲時(shí)間、超聲振幅3個(gè)因素作為單因素考察對(duì)象，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備空白納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，以粒徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察上述因素對(duì)其的影響。各因素水平見(jiàn)表1。

表1 單因素試驗(yàn)因素水平Tab.1 Factors and levels of single factor test

2.2.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)“2.2.2.2”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇攪拌時(shí)間、超聲時(shí)間和振幅3個(gè)因素作L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備空白納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，以粒徑分布為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳制備工藝。正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2。

表2 正交設(shè)計(jì)因素和水平Tab.2 Factors and levels of orthogonal design

2.2.2.4 工藝驗(yàn)證 處方為單硬脂酸甘油酯0.32 g，辛酸/癸酸三甘油酯0.08 g，蛋黃卵磷脂0.2 g，泊洛沙姆188 0.2 g，加重蒸餾水至20 mL。按“2.2.2.3”項(xiàng)下最佳工藝條件平行制備3批空白納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，檢測(cè)其粒徑分布。

2.2.3 魚腥草揮發(fā)油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體處方篩選

2.2.3.1 固體脂質(zhì)種類篩選 選擇泊洛沙姆188-蛋黃卵磷脂（1∶1）作為復(fù)合乳化劑，用量2%；揮發(fā)油投藥量1%；辛酸/癸酸三甘油酯作為液體脂質(zhì)，固-液脂質(zhì)比4∶1，總脂質(zhì)用量2%。分別采用單硬脂酸甘油酯、山崳酸甘油酯作為固體脂質(zhì)，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備魚腥草揮發(fā)油-納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，考察固體脂質(zhì)種類對(duì)其的影響。

2.2.3.2 固-液脂質(zhì)比例篩選 揮發(fā)油投藥量0.5%，單硬脂酸甘油酯-辛酸癸酸三甘油酯作為固-液脂質(zhì)，其余條件不變，考察固-液脂質(zhì)比例為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4時(shí)對(duì)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的影響。

2.2.3.3 脂質(zhì)用量篩選 固液脂質(zhì)比7∶3，其余條件不變，考察脂質(zhì)用量為0.5%、1%、2%、3%、4%、5%時(shí)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的粒徑分布和表面電位。

2.2.3.4 乳化劑配比及用量篩選 總脂質(zhì)用量1%，其余條件不變，考察乳化劑配比及用量對(duì)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的影響。

2.2.3.5 投藥量篩選 泊洛沙姆188-蛋黃卵磷脂比例2∶1，復(fù)合乳化劑用量4%，其余條件不變，考察投藥量為0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%時(shí)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體性狀的變化情況。

2.2.3.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化處方 依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇乳化劑量、脂質(zhì)用量、固/液脂質(zhì)比和投藥量4個(gè)因素作L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備魚腥草揮發(fā)油-納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，檢測(cè)其粒徑分布和Zeta電位，并以粒徑分布為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳處方。正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表3。

表3 正交設(shè)計(jì)因素和水平Tab.3 Factors and levels of orthogonal design

2.2.3.7 處方驗(yàn)證 按照“2.2.3.6”項(xiàng)下最佳處方條件，采用“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備3批魚腥草揮發(fā)油-納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，檢測(cè)其粒徑分布和Zeta電位。

2.3 魚腥草揮發(fā)油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制劑學(xué)評(píng)價(jià)

納米給藥系統(tǒng)能明顯改變藥物在體內(nèi)的吸收、分布與代謝行為，通常具有緩釋、控釋等作用，而小于100 nm的顆?？捎行П苊庋旱氖走^(guò)清除效應(yīng)。這些特性取決于載體自身的制劑學(xué)性質(zhì)，包括粒徑、Zeta電位、包封率、釋放特性等，故有必要對(duì)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制劑學(xué)性質(zhì)進(jìn)行詳細(xì)評(píng)價(jià)。

2.3.1 形態(tài)觀察 透射電鏡觀察魚腥草揮發(fā)油-納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的表面形態(tài)。將其混懸液適當(dāng)稀釋后，滴至覆有支持膜的銅網(wǎng)上，紅外燈下烘干水分，觀察納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體納米粒形態(tài)并拍照。

2.3.2 粒徑分布及Zeta電位 粒度分析是納米載藥系統(tǒng)的主要表征方面之一，通過(guò)一定的檢測(cè)手段來(lái)精確測(cè)量納米顆粒的粒徑，并對(duì)粒徑分布進(jìn)行分析。多分散系數(shù)（PdI）是粒徑分布的衡量指標(biāo)，PdI值越小，粒徑分布越窄，納米粒度越均勻；Pd I值越大，粒徑分布范圍越寬，納米粒間可能因相互碰撞造成聚集、團(tuán)聚，物理穩(wěn)定性差。

Zeta電位是指顆粒的剪切面電位，其絕對(duì)值越大，表示顆粒所攜帶的正或負(fù)電荷越多，顆粒之間的排斥力越大，整個(gè)體系相對(duì)穩(wěn)定；反之則穩(wěn)定性越差。

將魚腥草揮發(fā)油-納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體稀釋10倍，采用馬爾文納米粒度及Zeta電位分析儀檢測(cè)其粒徑分布及Zeta電位，平行3次，求出平均值。2.3.3 包封率

2.3.3.1 包封藥量測(cè)定 準(zhǔn)確量取魚腥草揮發(fā)油-納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體1 mL，置于超濾管內(nèi)管中，8 000 r/min離心20 min，收集納米粒，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，在“2.1.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，記錄甲基正壬酮峰面積。再

代入“2.1.7”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品質(zhì)量濃度。

2.3.3.2 總藥量測(cè)定 準(zhǔn)確量取魚腥草揮發(fā)油-納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體1 mL，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，在“2.1.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)，記錄甲基正壬酮峰面積。再代入“2.1.7”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品質(zhì)量濃度。

然后，按照如下公式計(jì)算制劑的包封率。

包封率＝（系統(tǒng)中包封的藥量/系統(tǒng)中包封與未包封的總藥量）×100%

2.3.4 載藥量 載藥量（DL）是指納米粒中所含藥物的質(zhì)量百分率，即載藥量＝（包封藥量/納米?？傎|(zhì)量）×100%

2.4 魚腥草揮發(fā)油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體穩(wěn)定性研究2.4.1 影響因素試驗(yàn)

2.4.1.1 高溫對(duì)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的影響 制備一批魚腥草揮發(fā)油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，密封分裝于潔凈的西林瓶中，60℃下避光放置10 d，于第0、5和10天取樣，觀察外觀變化，并檢測(cè)其粒徑分布和包封率。

2.4.1.2 強(qiáng)光照對(duì)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的影響 制備一批魚腥草揮發(fā)油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，密封分裝于潔凈的西林瓶中，放置在光照箱中，于25℃，（4 500±500）1x照度下放置10 d，于第0、5和10天取樣，觀察外觀變化，并檢測(cè)其粒徑分布和包封率。

2.4.2 短期儲(chǔ)藏穩(wěn)定性試驗(yàn) 將魚腥草揮發(fā)油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體密封分裝于潔凈的西林瓶中，避光放置在4℃和室溫3個(gè)月，于第1、7、15、30、60和90天取樣，觀察外觀變化，檢測(cè)粒徑和包封率。

3 結(jié)果與分析

3.1 制劑含量分析方法的建立

3.1.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 由甲基正壬酮對(duì)照品溶液、揮發(fā)油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體樣品溶液及空白納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體樣品溶液的GC色譜圖（圖1～3）可知，在設(shè)定的色譜條件下，甲基正壬酮出峰時(shí)間為19.63 min，而空白樣品在該位置無(wú)色譜峰出現(xiàn)，說(shuō)明制劑輔料對(duì)揮發(fā)油含有量測(cè)定無(wú)影響，該方法專屬性良好。

3.1.2 精密度考察 分別取低、中、高3種質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，氣相色譜檢測(cè)記錄峰面積，結(jié)果見(jiàn)表4。由表可知，3種質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液色譜峰面積的日間及日內(nèi)ISD值均小于3%，表明儀器的精密度良好。

3.1.3 檢測(cè)限及定量限 計(jì)算系列質(zhì)量濃度甲基正壬酮溶液色譜峰的信噪比（S/N）。結(jié)果，S/N＝3時(shí)對(duì)應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度為1.509 2 μg/mL，即檢測(cè)限；S/N＝10所對(duì)應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度為4.986 8 μg/mL，即定量限。

圖1 甲基正壬酮溶液GC色譜圖Fig.1 GC chromatogram of 2-undecanone

圖2 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體樣品GC色譜圖Fig.2 GC chromatogram of nanostructured lipid carrier sam ple

圖3 空白納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體樣品GC色譜圖Fig.3 GC chromatogram of blank nanostructured lipid carrier sam p le

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab.4 Results of precision tests（n＝5）

3.1.4 加樣回收率（表5） 由表可知，3種質(zhì)量濃度的加樣回收率均在95%～105%之間，而且ISD值較小，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度良好。

3.1.5 線性關(guān)系考察 以甲基正壬酮對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），峰面積（A）為縱坐標(biāo)（Y），標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y＝6 962.3X-11 527（r＝0.999 9），表明在4.986 8～399.929 5 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of recovery tests

3.2 魚腥草揮發(fā)油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備

3.2.1 空白納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制備工藝影響因素3.2.1.1 制備溫度 不同種類脂質(zhì)熔點(diǎn)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。由表可知，固體脂質(zhì)中加入液態(tài)脂質(zhì)能使熔點(diǎn)降低，黏度減小，更有利于小粒徑納米粒的形成，并選擇以單硬脂酸甘油酯為固體脂質(zhì)的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制備溫度60℃，以山崳酸甘油三酯為固體脂質(zhì)的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制備溫度75℃。

表6 不同種類脂質(zhì)體的熔點(diǎn)Tab.6 M elting points of different kinds of lipids

3.2.1.2 初乳攪拌時(shí)間 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑分布隨乳化攪拌時(shí)間的變化情況見(jiàn)表7。由表可知，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，其粒徑隨攪拌時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減小，多分散系數(shù)（PDI）也隨之降低，說(shuō)明粒度分布更均勻。為縮短制備時(shí)間，選擇攪拌10 min來(lái)考察其他因素對(duì)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的影響。

表7 攪拌時(shí)間對(duì)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑的影響Tab.7 Effect of stirring time on the particle size of nanostructured lipid carrier

3.2.1.3 超聲分散時(shí)間與振幅 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑分布隨超聲分散時(shí)間的變化情況見(jiàn)表8。由表可知，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，超聲分散時(shí)間越長(zhǎng)，所得納米粒徑越小，而且粒度分布更均勻。

表8 超聲分散時(shí)間對(duì)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑的影響Tab.8 Effect of u ltrasonic tim e on the particle size of nanostructured lipid carrier

3.2.1.4 超聲振幅 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑分布隨超聲振幅變化情況見(jiàn)表9。由表可知，超聲分散時(shí)的振幅對(duì)粒徑影響較大，納米粒粒徑隨其增大而減小，但對(duì)粒徑分布的影響較小。

表9 超聲振幅對(duì)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑的影響Tab.9 Effect of ultrasonic amp litude on the particle size of nanostructured lipid carrier

3.2.1.5 正交試驗(yàn)篩選最佳工藝 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇攪拌時(shí)間、超聲時(shí)間和振幅3個(gè)因素作L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以粒徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行方差分析及直觀分析，結(jié)果見(jiàn)表10和表11。

表10 方差分析Tab.10 Analysis of variance

按檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，3個(gè)因素中僅超聲振幅對(duì)納米粒徑具有顯著性影響（P＜0.05）。

直觀分析結(jié)果顯示，極差值C＞B＞A，即3個(gè)因素對(duì)粒徑的影響程度順序?yàn)镃（超聲振幅）＞B（超聲時(shí)間）＞A（攪拌時(shí)間）；均值KA1＞KA2＞KA3，KB1＞KB3＞KB2，KC1＞KC2＞KC3，由于納米粒徑越小越好，故較優(yōu)水平為A3B2C3，但因?yàn)镵A2與KA3非常接近，從縮短生產(chǎn)周期的角度考慮，決定選擇A2。綜上所述，最佳因素水平為A2B2C3，即初乳攪拌20 min，超聲分散10 min，振幅100%。

表11 直觀分析Tab.11 Intuitive analysis

3.2.1.6 最佳工藝驗(yàn)證 按照最佳工藝制備的空白納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑小，粒度均勻，而且Zeta電位絕對(duì)值較大，說(shuō)明納米粒穩(wěn)定。同時(shí)，納米粒徑的ISD為1.18%，表明該工藝重復(fù)性好，穩(wěn)定可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果見(jiàn)表12。

表12 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.12 Results of verification tests

3.2.2 魚腥草揮發(fā)油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體處方篩選3.2.2.1 固體脂質(zhì)種類篩選 兩種固體脂質(zhì)相比，單硬脂酸甘油酯納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的粒徑更小，粒度分布均勻，而且穩(wěn)定性更好，其平均粒徑ISD 為2.21%，而山崳酸三甘油酯納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的平均粒徑ISD為5.64%。因此，選擇單硬脂酸甘油酯作為納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的固體脂質(zhì)。篩選結(jié)果見(jiàn)表13。

表13 固體脂質(zhì)種類對(duì)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑及Zeta電位的影響Tab.13 Effects of solid lipid type on the particle size and Zeta potential of nanostructured lipid carrier

3.2.2.2 固-液脂質(zhì)比例篩選 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的粒徑分布及Zeta電位隨固液脂質(zhì)比例變化情況見(jiàn)表14。由表可知，隨著液體脂質(zhì)比例的增大，納米粒粒徑逐漸減小，PDI值也總體降低。

表14 固/液脂質(zhì)比例對(duì)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑及Zeta電位的影響Tab.14 Effects of lipid solid/liquid ratio on the particle size and Zeta potential of nanostructured lipid carrier

3.2.2.3 脂質(zhì)用量篩選 隨著體系中脂質(zhì)總量的增加，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑呈明顯增大的趨勢(shì)，PDI與Zeta電位的變化均表明體系的物理穩(wěn)定性降低。由于脂質(zhì)量0.5%與1%的粒徑差別不大，考慮到單位體積制劑中，脂質(zhì)量越大，所能承載的揮發(fā)油越多。因此，結(jié)合粒徑分布及體系穩(wěn)定性，選擇適宜的脂質(zhì)用量為1%。篩選結(jié)果見(jiàn)表15。

表15 脂質(zhì)用量對(duì)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑及Zeta電位的影響Tab.15 Effects of lipid dosage on the particle size and Zeta potential of nanostructured lipid carrier

3.2.2.4 乳化劑配比及用量篩選 單獨(dú)使用泊洛沙姆188制得的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體穩(wěn)定性很差；單獨(dú)使用蛋黃卵磷脂制得的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑很大，而且粒度分布不均，如兩者結(jié)合使用，則能顯著彌補(bǔ)對(duì)方的缺陷。復(fù)合表面活性劑用量相等時(shí)，泊洛沙姆188比例越大，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑越小；復(fù)合表面活性劑配比固定時(shí)，用量越大，則粒徑越小。綜合考慮粒徑及體系穩(wěn)定性，選擇復(fù)合乳化劑為泊洛沙姆188-蛋黃卵磷脂（2∶1），用量4%。篩選結(jié)果見(jiàn)表16。

3.2.2.5 投藥量篩選 隨著揮發(fā)油投藥量的增加，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的粒徑呈先減小后增大的趨勢(shì)，Zeta電位絕對(duì)值也隨之先增大后減小。魚腥草揮發(fā)油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的體系呈淡黃色，而且隨投藥量增加，顏色逐漸加深。另外，3～7號(hào)樣品瓶?jī)?nèi)壁附著一圈細(xì)小的油滴，可能是未被包封的過(guò)量揮發(fā)油。從節(jié)省成本的角度出發(fā)，選擇投藥量0.5%。篩選結(jié)果見(jiàn)表17。

表16 乳化劑的成分及用量對(duì)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑及Zeta電位的影響Tab.16 Effects of constituent and dosage of emulsifier on the particle size and Zeta potential of nanostructured lipid carrier

表17 揮發(fā)油量對(duì)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑及Zeta電位的影響Tab.17 Effects of volatile oil dosage on the particle size and Zeta potential of nanostructured lipid carrier

3.2.2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化處方 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇乳化劑量、脂質(zhì)用量、固-液脂質(zhì)比和投藥量4個(gè)因素作L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以粒徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，正交試驗(yàn)方差分析顯示，被考察的4個(gè)因素對(duì)納米粒粒徑的影響均不明顯。直觀分析見(jiàn)表18。

直觀分析結(jié)果顯示，極差值B＞D＞A＞C，即4個(gè)因素對(duì)粒徑的影響程度順序?yàn)锽（脂質(zhì)量）＞D（投藥量）＞A（乳化劑量）＞C（固/液脂質(zhì)比）；均值KA1＞KA2＞KA3，KB3＞KB2＞KB1，KC1＞KC2＞KC3，KD1＞KD2＞KD3，由于納米粒徑越小越好，故最佳因素水平為A3B1C3D3，即復(fù)合乳化劑泊洛沙姆188-蛋黃卵磷脂（2∶1）用量4%，混合脂質(zhì)單硬脂酸甘油酯-辛酸癸酸三甘油酯（6∶4）用量1%，揮發(fā)油投藥量0.5%。綜上所述，最佳處方為單硬脂酸甘油酯0.12 g，辛酸癸酸三甘油酯0.08 g，泊洛沙姆1 880.533 g，蛋黃卵磷脂0.267 g，魚腥草揮發(fā)油0.1 g，重蒸餾水加至20 mL。

表18 直觀分析Tab.18 Intuitive analysis

3.2.2.7 最佳處方驗(yàn)證 按照正交試驗(yàn)所得的最佳工藝及處方，按“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備3批納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，檢測(cè)其粒徑分布和Zeta電位，結(jié)果見(jiàn)表19。由表可知，按照最佳工藝及處方制備的魚腥草揮發(fā)油-納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑小，而且粒度分布均勻，Zeta電位絕對(duì)值較大，說(shuō)明納米粒穩(wěn)定。同時(shí)，納米粒徑的ISD為2.46%，表明其重復(fù)性好，穩(wěn)定可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

表19 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.19 Results of verification tests

3.3 魚腥草揮發(fā)油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制劑學(xué)評(píng)價(jià)

3.3.1 形態(tài)觀察 透射電鏡下觀察魚腥草揮發(fā)油-納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，見(jiàn)圖4。由圖可知，納米粒呈圓球狀，輪廓規(guī)整，粒度分布比較均勻，無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象。

3.3.2 粒徑分布及Zate電位 將魚腥草揮發(fā)油-納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體稀釋10倍，馬爾文納米粒度及Zeta電位分析儀檢測(cè)其粒徑分布及Zeta電位，平行3次，計(jì)算平均值。結(jié)果見(jiàn)圖5～6。

圖4 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體透射電鏡圖Fig.4 Transm ission electron m icrographs of nanostructured lipid carrier

圖5 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑分布Fig.5 Particle size distribution of nanostructured lipid carrier

圖6 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體Zeta電位分布Fig.6 Zeta potential distribution of nanostructured lipid carrier

魚腥草揮發(fā)油-納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的粒度呈單峰分布，平均粒徑為（70.76±1.74）nm，粒徑介于10～100 nm之間的納米粒約占總數(shù)的96.4%。

由圖可知，魚腥草揮發(fā)油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的Zeta電位為（-25.40±1.08）mV，體系較穩(wěn)定。3.3.3 包封率和載藥量 平行制備3批魚腥草揮發(fā)油-納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，按照“2.3.4”和“2.3.5”項(xiàng)下方法檢測(cè)其包封率和載藥量，結(jié)果見(jiàn)表20。由表可知，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的載藥量為5.76%，包封率為90.33%，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)（＞80%）。

表20 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體包封率和載藥量Tab.20 Entrapment efficiencies and drug loadings of nanostructured lipid carrier

3.4 魚腥草揮發(fā)油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體穩(wěn)定性研究

3.4.1 影響因素試驗(yàn)

3.4.1.1 高溫對(duì)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的影響 在60℃下，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體平均粒徑未發(fā)生明顯變化，到第5天時(shí)出現(xiàn)少量粒度在10～30 nm之間的粒子，到第10天時(shí)降至10～20 nm之間，而且包封率略有降低，可能是由于高溫而導(dǎo)致一小部分不穩(wěn)定的納米粒破碎。新制備的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體體系呈淡黃色，澄清透明，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，顏色逐漸加深，透明度下降，但無(wú)沉淀析出。具體見(jiàn)表21。

表21 高溫對(duì)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的影響Tab.21 Effect of high temperature on nanostructured lipid carrier

3.4.1.2 強(qiáng)光照對(duì)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的影響 強(qiáng)光照對(duì)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的粒徑和包封率均無(wú)明顯影響，但觀察到其體系澄清度有所下降，顏色變?yōu)榈榘咨＞唧w見(jiàn)表22。

表22 強(qiáng)光照對(duì)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的影響Tab.22 Effect of strong light on nanostructured lipid carrier

3.4.2 短期穩(wěn)定性考察

3.4.2.1 外觀變化 在90 d的考察期內(nèi)，室溫下放置的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體外觀基本未發(fā)生變化，到第90天時(shí)體系仍澄清透明。但4℃下其外觀變化明顯，到15 d時(shí)體系較第1天明顯渾濁，第30天時(shí)水分散液已完全不透明，第90天時(shí)體系已變?yōu)榘咨闋钜骸?/p>

3.4.2.2 粒徑和包封率變化 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體在室溫下放置90 d后，平均粒徑無(wú)明顯變化，但包封率顯著下降，第30天時(shí)已低于藥典要求（≥80%），第90天時(shí)降至64.44%；在4℃下隨時(shí)間的延長(zhǎng)，其粒徑明顯增大，粒度分布范圍變寬，系統(tǒng)穩(wěn)定性降低，包封率也顯著減少。在相同時(shí)間下，放置在室溫的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體粒徑明顯小于放置在4℃者。因此，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體應(yīng)選擇在室溫條件下保存。具體見(jiàn)表23。

表23 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體在室溫及4℃下的穩(wěn)定性Tab.23 Stabilities of nanostructured lipid carrier at room temperature and 4℃

4 討論

包封率測(cè)定過(guò)程中分離納米粒與游離藥物的方法有很多，如超速離心法、葡聚糖凝膠柱色譜法、透析法、超濾離心法等。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，魚腥草揮發(fā)油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體經(jīng)高速離心后，納米粒上浮，放置一段時(shí)間后重新擴(kuò)散，不利于其收集，而葡聚糖凝膠色譜柱也無(wú)法將所制備的納米粒與游離藥物很好地分離。若選擇適當(dāng)型號(hào)的超濾管，通過(guò)超濾離心法則可將分散體系中的水分濾除，從而得到濃集的納米粒。因此，本實(shí)驗(yàn)最終采用超濾法測(cè)定納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體包封率，考慮到制劑粒徑分布，選擇截留分子質(zhì)量為100 kDa的超濾管。

本實(shí)驗(yàn)采用熔融乳化-超聲分散法，制備了魚腥草揮發(fā)油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，平均粒徑約為（70.76±1.74）nm，Zeta電位為（-25.40±1.08）mV，包封率90.33%，載藥量5.76%。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，高溫會(huì)導(dǎo)致其外觀顏色的改變，故該制劑應(yīng)放置在室溫條件下密閉保存。

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體以生物相容性好、可降解的固-液混合脂質(zhì)為載體材料，尤其適用于包載揮發(fā)油類藥物，為其提供穩(wěn)定的包封環(huán)境，并能有效改善難溶性藥物的吸收和分布行為［11］，提高藥物的生物利用度。文獻(xiàn)［12-14］報(bào)道，粒徑在50 nm左右的納米粒可直接通過(guò)消化道上皮細(xì)胞，吸收進(jìn)入體循環(huán)或淋巴循環(huán)系統(tǒng)，從而有效降低口服給藥的肝臟首過(guò)效應(yīng)。因此，基于納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的這些特點(diǎn)，有希望開發(fā)出新型魚腥草揮發(fā)油口服制劑。

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［質(zhì) 量］

*通信作者：趙 寧（1990—），女，碩士生，研究方向?yàn)樾聞┬团c新型給藥系統(tǒng)。Te1：18703675693，E-mai1：zhaoningwyyx@ 163.com

作者簡(jiǎn)介：張壯麗（1978—），女，博士，助理研究員，研究方向?yàn)橹兴幮滤?。Te1：（0371）66658204，E-mai1：zz17814@163.com

基金項(xiàng)目：河南省省屬科研單位社會(huì)公益項(xiàng)目預(yù)研專項(xiàng)（2013，2014）；河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（142102310433）

收稿日期：2015-05-18

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.015

中圖分類號(hào)：I944

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1528（2016）03-0546-10