耿曉華，李明闖，程習輝

(鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院，鄭州 450007)

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髓母細胞瘤組織中SIRT6的表達觀察

耿曉華，李明闖，程習輝

(鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院，鄭州 450007)

目的觀察髓母細胞瘤組織中沉默信息調節(jié)因子6(SIRT6)的表達變化。方法20例份髓母細胞瘤組織(腫瘤組)，20例份瘤旁正常組織(瘤旁組)，采用RT-PCR法檢測兩組SIRT6 mRNA，Western blotting法檢測SIRT6蛋白。結果腫瘤組、瘤旁組SIRT6 mRNA相對表達量分為0.21±0.16、1.01±0.27，SIRT6蛋白相對表達量分別為0.54±0.14、1.25±0.12，兩組比較，P均<0.05。結論髓母細胞瘤組織中SIRT6 mRNA、蛋白表達降低。

髓母細胞瘤；沉默信息調節(jié)因子6

髓母細胞瘤是高度惡性的神經(jīng)上皮組織腫瘤，也是兒童常見的惡性腫瘤之一，其預后較差，目前發(fā)病機制仍不清楚。沉默信息調節(jié)因子6(SIRT6)屬Sirtuin家族成員之一[1]，其位于細胞核內，具有去乙?；负虯DP-核糖轉移酶活性的作用，在人和小鼠多種組織中都有表達[2]，在人類大腦中亦呈高表達狀態(tài)，對神經(jīng)細胞的萎縮、代謝均有影響[3]。Chen等[4]發(fā)現(xiàn)，SIRT6可以抑制神經(jīng)膠質瘤細胞在體內的生長。目前，關于SIRT6與髓母細胞瘤關系的研究鮮有報道。本研究采取RT-PCR法和Western blotting法分別對髓母細胞瘤組織中SIRT6 mRNA、蛋白進行檢測，以探討其在髓母細胞瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2012年1月～2015年7月鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院收治的髓母細胞瘤患者20例，男13例，女7例；年齡5～45歲；病程1周～4個月。所有患者術前均未接受化療、放療及其他治療。手術留取腫瘤組織及瘤旁組織各20例份(分別計為腫瘤組和瘤旁組)。

1.2SIRT6 mRNA檢測方法采用RT-PCR法。兩組分別稱取50 mg組織，在液氮中研磨后移入EP管，加入1 mL TRIzol，冰浴充分勻漿，室溫靜5 min；4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，將上清轉移到新的EP管中。每管中加入200 μL氯仿，渦旋儀劇烈渦旋30 s，冰盒放置3 min；12 000 r/min 離心15 min，取上層無色的水相；加入200 μL異丙醇，反復顛倒混勻，室溫靜置20 min；12 000 r /min離心10 min，保留沉淀；加入預冷的1 mL的75%乙醇，渦旋儀振蕩混勻；4 ℃下以7 500 r/min 離心5 min，小心去除上清，將RNA沉淀置于超凈臺通風干燥處理10 min；每管中加入30 μL去離子水溶解RNA沉淀，-70 ℃凍存?zhèn)溆谩２捎肕-MLV逆轉錄酶反轉錄mRNA后，進行熒光定量PCR檢測，所有操作均按試劑說明書進行。

1.3SIRT6蛋白檢測方法采用Western blotting法。將組織置于液氮中冷凍，后迅速放于研缽中研磨成粉末狀，移入EP管中，加入總蛋白提取液，置于冰上，超聲波振蕩3次，每次10 s，后冰上靜置10 min。置于低溫高速離心機，4 ℃下以10 000 r/min離心5 min，取上清以BCA法測定蛋白濃度。加入溴酚藍后進行變性。配制10%分離膠，取等量樣品上樣于聚丙烯酰胺凝膠，電泳，至溴酚藍跑到膠底部。將聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)過轉膜儀轉至PVDF膜上，用封閉液封閉該PVDF膜60 min，洗膜3次，將轉膜后的膜蛋白面朝下平鋪于保鮮膜上的一抗液中，排除氣泡，常溫搖床孵育，2 h后以TBST清洗，每次10 min。酶標二抗與一抗結合，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。顯色后用Image J分析軟件進行分析，檢測其IOD累積光密度參照值，并計算每組目的蛋白對比內參表達的相對值，以此作為目的蛋白的相對表達量。

2　結果

腫瘤組、瘤旁組SIRT6 mRNA相對表達量分為0.21±0.16、1.01±0.27，SIRT6蛋白相對表達量分別為0.54±0.14、1.25±0.12，兩組比較，P均<0.05。

3　討論

Sirtuins家族為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性的組蛋白去乙酰化酶，包含7個成員(SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7)，其分布廣泛，功能復雜多樣[5,6]，SIRT6屬Sirtuin家族成員之一，同時具有去乙?；负虯DP-核糖轉移酶活性作用[7]，與神經(jīng)生長、腫瘤發(fā)生有關[3]。目前已經(jīng)證實，SIRT6參與了包括神經(jīng)膠質瘤、肝癌、乳腺癌、胰腺癌和結腸癌等[4,8,9]多種腫瘤的發(fā)生，且在不同腫瘤中發(fā)揮作用不同[10]，而關于髓母細胞瘤中SIRT6mRNA轉錄情況及蛋白表達情況鮮有報道。

本研究顯示，腫瘤組SIRT6 mRNA、蛋白相對表達量低于瘤旁組，表明SIRT6可能參與了髓母細胞瘤的發(fā)生。從上述結果可以看出，不管是在轉錄水平，還是在蛋白水平，SIRT6在髓母細胞瘤中的表達明顯低于瘤旁正常組織，提示SIRT6在髓母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著抑制作用。這與此前報道[4,8,11]SIRT6在肝癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質瘤中表達下調結果一致。SIRT6在腫瘤形成中發(fā)揮抑制作用的機制尚不清楚，可能是通過直接與腫瘤抑制因子、致癌蛋白相互作用，調節(jié)腫瘤發(fā)展或通過調節(jié)組蛋白的乙酰化3賴氨酸9致癌基因的啟動子，通過抑制ERK1/2信號通路而抑制腫瘤細胞的增長[4,11～13]。但也有報道[10,14]，SIRT6在某些腫瘤中表達高于正常組織，如前列腺癌、子宮內膜癌。

總之，髓母細胞瘤組織中SIRT6 mRNA及蛋白表達異常，推測其在髓母細胞瘤中可能發(fā)揮抑癌作用。

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