陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)系 (咸陽 712000)

耿朝萌 　劉林波　郭瑞林△　蘇　冰△ 　張曉雪△

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·臨床檢驗(yàn)·

大腸埃希菌生物膜兩種檢測方法對比研究

陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)系 (咸陽 712000)

耿朝萌 劉林波郭瑞林△蘇冰△張曉雪△

摘要目的：剛果紅-阿利新藍(lán)聯(lián)合染色和半定量粘附實(shí)驗(yàn)檢測大腸埃希菌生物膜的敏感性和特異性比較。方法：對臨床分離的83株大腸埃希菌進(jìn)行生物膜形成實(shí)驗(yàn)，分別經(jīng)剛果紅-阿利新藍(lán)聯(lián)合染色和半定量粘附實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)抽取25株進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察。結(jié)果：臨床分離的83株大腸埃希菌經(jīng)剛果紅-阿利新藍(lán)聯(lián)合染色陽性率37.3%，敏感性81.8%，特異性100%；半定量粘附實(shí)驗(yàn)陽性率45.8%，敏感性100%，特異性78.6%；兩種檢測方法比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：剛果紅-阿利新藍(lán)聯(lián)合染色、半定量粘附實(shí)驗(yàn)均可用于大腸埃希菌生物膜的檢測。

主題詞@大腸埃希菌生物膜/細(xì)胞學(xué)剛果紅-阿利新藍(lán)聯(lián)合染色細(xì)菌粘附染色與標(biāo)記顯微鏡檢查，共焦比較研究

細(xì)菌生物膜形成在細(xì)菌感染中的作用已引起廣泛關(guān)注，對生物膜的檢測也得到了越來越高的重視，出現(xiàn)了各類不同的檢測方法[1-5]。本文對我院臨床分離的83株大腸埃希菌在體外能否形成生物膜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并分別采用剛果紅-阿利新藍(lán)聯(lián)合染色，半定量粘附實(shí)驗(yàn)，比較其陽性檢出率、敏感性和特異性，對其臨床意義進(jìn)行探討，現(xiàn)報告如下。

資料與方法

1實(shí)驗(yàn)菌株、主要試劑與儀器收集2014年8～11月陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床標(biāo)本中分離的83株大腸埃希菌，刪除同一患者相同感染部位分離的重復(fù)分離菌株，所有菌株均經(jīng)臨床鑒定。LB肉湯，剛果紅(中國遠(yuǎn)航試劑廠)，阿利新藍(lán)8GX(上海如吉生物科技有限公司)，結(jié)晶紫為國產(chǎn)分析純，光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS)，激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8),全自動酶標(biāo)儀等。

2 方法

2.1剛果紅-阿利新藍(lán)聯(lián)合染色:

2.1.1阿利新藍(lán)染液：阿利新藍(lán)2 g，冰醋酸3 ml，蒸餾水97 ml，用前過濾；剛果紅染液：剛果紅 0.5g，50%酒精100 ml。

2.1.2剛果紅-阿利新藍(lán)聯(lián)合染色：將少量的無菌生理鹽水滴于經(jīng)高壓滅菌的載玻片上，從血平板上挑取少許活化的菌落與之混勻，再滴加阿利新藍(lán)染液,室溫下靜置10～20min后，經(jīng)火焰干燥后再滴加少許剛果紅染液，涂布均勻,室溫下染色5min,用蒸餾水沖洗至無染料流下為止，濾紙吸干后油鏡下觀察。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

結(jié)果判斷：形成生物膜的細(xì)菌為淡紅色，胞外多糖等為深紅色，細(xì)胞之間邊界不清，深紅色的胞外多糖聚集成團(tuán)并包裹于菌體周圍。

2.2半定量粘附實(shí)驗(yàn): 參照文獻(xiàn)[1]方法進(jìn)行，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2.3激光共聚焦顯微鏡: 隨機(jī)抽取25株大腸埃希菌，參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行CLSM掃描。

2.4統(tǒng)計學(xué)方法：運(yùn)用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件，采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

結(jié)果

1兩種方法對大腸埃希菌生物膜的陽性檢出率83株臨床分離的大腸埃希菌中，經(jīng)剛果紅-阿利新藍(lán)聯(lián)合染色實(shí)驗(yàn)和半定量粘附實(shí)驗(yàn)分別有31株和38株形成生物膜，其陽性率分別為37.3%、45.8%，兩種方法的檢出率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.21，P>0.05)。

2兩種方法敏感性和特異性的比較隨機(jī)抽取的25株大腸埃希菌經(jīng)CLSM觀察有11株形成生物膜，剛果紅-阿利新藍(lán)聯(lián)合染色實(shí)驗(yàn)有9株陽性，半定量粘附實(shí)驗(yàn)有11株陽性，隨機(jī)抽取的25株經(jīng)CLSM觀察有14株未形成生物膜，剛果紅-阿利新藍(lán)聯(lián)合染色實(shí)驗(yàn)有14株陰性，半定量粘附實(shí)驗(yàn)有11株陰性。兩種方法的敏感性與特異性分別為81.8%、100%和100%、78.6%。

討論

生物膜(Biofilm,BF)是與浮游菌相對應(yīng)的存在形式，是細(xì)菌在生長過程中為適應(yīng)外界環(huán)境，粘附于生物或非生物表面，由自身細(xì)胞產(chǎn)生的胞外聚合物(胞外多糖、胞外DNA和蛋白等)及其基質(zhì)包裹的具有三維結(jié)構(gòu)的菌細(xì)胞群體。細(xì)菌形成生物膜是引起持續(xù)性、反復(fù)性感染的常見致病機(jī)制，大腸埃希菌形成的生物膜可以引起前列腺炎、膽道感染、導(dǎo)尿管相關(guān)性膀胱炎等對人類健康造成極其嚴(yán)重危害的疾病，并與外科手術(shù)植入物[6-7]等相關(guān)感染有緊密聯(lián)系。有報道表明細(xì)菌生物膜的形成常常也是導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)和藥物治療失敗的重要原因。

生物膜的檢測主要有定性、定量檢測和形態(tài)學(xué)觀察。主要的檢測方法有剛果紅-阿利新藍(lán)聯(lián)合染色、半定量粘附實(shí)驗(yàn)[1]、菌落計數(shù)法[2]、剛果紅實(shí)驗(yàn)[3]、銀染法[4]、掃描電鏡或CLSM[5]的形態(tài)學(xué)觀察。本文對我院臨床分離的83株大腸埃希菌在體外生物膜形成能力進(jìn)行檢測，分別采用剛果紅-阿利新藍(lán)聯(lián)合染色、半定量粘附實(shí)驗(yàn)，比較其陽性檢出率有無統(tǒng)計學(xué)差異。隨機(jī)抽取其中25株，以CLSM觀察結(jié)果為真陽性標(biāo)準(zhǔn)，檢測剛果紅-阿利新藍(lán)聯(lián)合染色，半定量粘附實(shí)驗(yàn)的敏感性和特異性。

剛果紅作為指示劑的選擇培養(yǎng)基被廣泛應(yīng)用于生物膜形成的定性檢查，而阿利新藍(lán)在組織細(xì)胞化學(xué)中常規(guī)應(yīng)用于酸性粘多糖及粘蛋白染色，因此，剛果紅-阿利新藍(lán)聯(lián)合染色應(yīng)用于細(xì)菌胞外糖染色效果較佳。其操作方法相對簡便，實(shí)驗(yàn)結(jié)果易于觀察，但阿利新藍(lán)染液的pH值在實(shí)驗(yàn)中非常重要，在pH2.5時染色效果最佳，但剛果紅在酸性條件下會形成棕黑色沉淀，故在染色過程中滴剛果紅染液之前需將阿利新藍(lán)染液中的冰醋酸完全揮發(fā)。半定量粘附實(shí)驗(yàn)[1]為胞外粘附基質(zhì)的結(jié)晶紫染色法，因其能通過吸光度間接反應(yīng)生物膜的形成量，而多用于微孔板、試管等小容器中的生物膜的半定量分析。其實(shí)驗(yàn)所需試劑及器材成本較低，實(shí)驗(yàn)條件要求不高而被一般的臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用，但對于需動態(tài)觀察生物膜的形成并不適用。CLSM不僅可以觀察到生物膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)還可以對標(biāo)本進(jìn)行斷層掃描，再通過三維重建得到標(biāo)本的立體結(jié)構(gòu)以顯示生物膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并可與圖像處理軟件如ISA軟件[5]將三維圖像數(shù)據(jù)化，且減少了掃描電鏡繁瑣的制片過程對生物膜結(jié)構(gòu)的破壞。同時，CLSM也可與熒光原位雜交技術(shù)(FISH)相結(jié)合，更直觀的反應(yīng)生物膜中活菌與死菌的比例，更真實(shí)地反映生物膜形態(tài)結(jié)構(gòu)與細(xì)菌之間的關(guān)系，并可同時檢測多種屬細(xì)菌。但是，CLSM價格昂貴，且實(shí)驗(yàn)條件要求較高，難以滿足一般臨床實(shí)驗(yàn)室對生物膜形成能力的評估要求。

大腸埃希菌是多種易形成生物膜的院內(nèi)感染細(xì)菌之一。本文采用的兩種檢測方法檢測本院臨床分離的83株大腸埃希菌生物膜的陽性檢出率分別為37.3%、45.8%，無統(tǒng)計學(xué)差異。但我院臨床分離的大腸埃希菌形成生物膜的檢出率明顯低于文獻(xiàn)[8]的報道。本實(shí)驗(yàn)以CLSM觀察結(jié)果為真陽性標(biāo)準(zhǔn)，剛果紅-阿利新藍(lán)聯(lián)合染色的敏感性為81.8%、特異性為100%，半定量粘附實(shí)驗(yàn)的敏感性為100%、特異性為78.6%。因此，在觀察生物膜形成的實(shí)驗(yàn)中，特別是標(biāo)本量較大的實(shí)驗(yàn)中，可考慮利用半定量粘附實(shí)驗(yàn)的敏感性高、特異性相對較低的特點(diǎn)，對菌株是否形成生物膜進(jìn)行過篩檢查，可疑菌株則可用剛果紅-阿利新藍(lán)聯(lián)合染色特異性高的特點(diǎn)加以證實(shí)。

據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)和美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)估計，約60%～80%的人類細(xì)菌感染性疾病的發(fā)生與生物膜有關(guān)。近年來，隨著人工假體、各種導(dǎo)管等醫(yī)療材料的廣泛應(yīng)用，人口老齡化及免疫低下人群的出現(xiàn)，使生物膜感染在醫(yī)院細(xì)菌感染中所占比例逐年上升，并且感染后果日趨嚴(yán)重。因此，生物膜檢測方法的優(yōu)化不容忽視，并且還需要大量實(shí)驗(yàn)廣泛而深入的研究，才能得到客觀、準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，為臨床生物膜的檢出及對細(xì)菌生物膜耐藥性的研究提供可靠的幫助。

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(收稿：2015-04-24)

【中圖分類號】R446.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.03.046

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