戎 蓉， 沈 熊， 黃琦蕓

（1.上海市精神衛(wèi)生中心藥劑科，上海200030；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院藥劑科，上海200032）

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HPLC法同時測定四味姜黃湯散中3種成分

戎 蓉1， 沈 熊2*， 黃琦蕓2*

（1.上海市精神衛(wèi)生中心藥劑科，上海200030；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院藥劑科，上海200032）

摘要：目的 建立HPLC法同時測定藏藥四味姜黃湯散（姜黃、小檗皮、余甘子、蒺藜）中鹽酸小檗堿、槲皮素和姜黃素的含有量。方法 四味姜黃湯散甲醇-10％鹽酸提取液的分析采用菲羅門Luna-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1％磷酸-乙腈，梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；檢測波長為360 nm（鹽酸小檗堿、槲皮素）和428 nm（姜黃素）；柱溫30℃。結(jié)果 鹽酸小檗堿、槲皮素和姜黃素的線性范圍分別為39.6～198 μg/mL、0.326～1.63 μg/mL和25.6～128 μg/mL（r≥0.999 8）。3種成分的平均回收率在96.9％～98.9％之間。結(jié)論 該方法簡單、靈敏、準(zhǔn)確，可用于四味姜黃散的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：四味姜黃湯散，鹽酸小檗堿；槲皮素；姜黃素；高效液相色譜

黃琦蕓，女，主管藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)工作。E-mai1：huang.qiyun@zs-hospita1.sh.cn

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2015-08-28

四味姜黃湯散收錄于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)——藏藥第一冊，由姜黃15 g、小檗皮12.5 g、余甘子和蒺藜各25 g組成，具有清熱，利尿等功效，用于尿道炎、尿頻、尿急［1-2］。目前已有文獻(xiàn)報道采用高效液相色譜法（HPLC）分別測定其中姜黃的有效成分姜黃素［1-2］和余甘子中的有效成分沒食子酸［3］，但尚未見測定其中小檗皮的有效成分鹽酸小檗堿，以及蒺藜有效成分槲皮素的報道。本實驗在參考文獻(xiàn)［4-6］的基礎(chǔ)上，采用HPLC法同時測定四味姜黃湯散中的鹽酸小檗堿、槲皮素和姜黃素的含有量，為制定其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

Agi1ent 1200高效液相色譜儀，包括G1312A二元泵、G1314D可見紫外光檢測器等（美國安捷倫公司）；Agi1ent ChemStation B.04.02工作站；賽多利斯R200D電子天平（德國賽多利斯公司）；KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）。

四味姜黃湯散各味藥材均購自上海市藥材有限公司，由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院藥劑科中藥房張曉康主管藥師鑒定，并按文獻(xiàn)［1］方法制成四味姜黃湯散。鹽酸小檗堿、槲皮素和姜黃素對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 菲羅門Luna-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為0.1％磷酸溶液（每100 mL含0.15 g庚烷磺酸鈉），流動相B為乙腈，梯度洗脫（0～45 min，25％～84％B）；檢測波長為360 nm（0～32 min）、428 nm（32～45 min）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 μL。色譜圖見圖1。

1.鹽酸小檗堿 2.槲皮素 3.姜黃素1.berberine hydroch1orid 2.quercetin 3.curcumin圖1　高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對照品16.3 mg于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得槲皮素貯備液。分別精密稱取鹽酸小檗堿對照品19.8 mg和姜黃素對照品12.8 mg，置同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解，精密吸取并加入上述槲皮素貯備液0.1 mL，再加甲醇稀釋至刻度，即得混合對照品貯備溶液。每1 mL分別含鹽酸小檗堿1.98 mg、槲皮素0.016 3 mg、姜黃素1.28 mg。冷藏，避光備用。

2.3 供試品溶液的制備 取四味姜黃湯散供試品約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇-10％鹽酸（5∶1，V/V）溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲30 min，再稱定質(zhì)量，用同一溶劑補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，續(xù)濾液用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 陰性供試品溶液的制備 制劑中小檗皮含有小檗堿，蒺藜含有槲皮素，姜黃含有姜黃素。分別制備缺上述藥材的陰性供試品，并按照“2.3”項下方法，制備各陰性供試品溶液。

將對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液分別按“2.1”色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果顯示，供試品溶液色譜中呈現(xiàn)與鹽酸小檗堿、槲皮素、姜黃素對照品保留時間相對應(yīng)的色譜峰，陰性供試品溶液無干擾，色譜圖見圖1。

2.5 線性關(guān)系 精密吸取“2.2”項下制備的混合對照品貯備溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 至10 mL量瓶中，加50％甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件操作，記錄峰面積，以峰面積值（Y）對進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得鹽酸小檗堿、槲皮素、姜黃素的回歸方程（n =5）分別為Y=8 636.3X+125.8（r=0.999 8，39.6～198 μg/mL）；Y=2 178.2X+421.9（r=0.999 9，0.326～1.63 μg/mL）；Y=6 895.7X+392.7（r= 0.999 9，25.6～128 μg/mL）；

2.6 精密度試驗 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液0.5 mL至10 mL量瓶中，加50％甲醇稀釋至刻度，按“2.1”項下條件測定，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿、槲皮素和姜黃素的峰面積RSD值分別為2.4％、2.9％和2.3％，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗 取同一批四味姜黃湯散6份，按“2.3”項下方法平行制備6份，按上述色譜條件測定，將測定鹽酸小檗堿、槲皮素和姜黃素的峰面積代入“2.5”項下的回歸方程。結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿、槲皮素和姜黃素的RSD分別為2.1％、2.2％、2.9％，表明方法的重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液室溫下避光放置，分別于0、2、4、6、8 h按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，測定各成分的峰面積。結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿、槲皮素和姜黃素峰面積RSD值分別為2.5％、2.9％、1.8％，表明在室溫避光條件下，供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收試驗 取同一批已知含有量的供試品6份，每份1 g，精密稱定。分別精密加入一定量的鹽酸小檗堿（1.98 mg/mL）、槲皮素（0.016 3 mg/mL）和姜黃素（1.28 mg/mL）對照品溶液，按“2.3”項下方法制備，依法測定。結(jié)果見表1。

2.10 樣品測定 根據(jù)處方比例分別制備3批供試品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下方法測定，結(jié)果見表2。

表1　加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of recovery tests（n=6）

表2　樣品含有量測定（n=3）Tab.2 Determ ination of sam p le contents（n=3）

3 討論

處方中小檗皮主要活性成分為鹽酸小檗堿［7］，具有抗菌、消炎，降壓等作用，可以用于治療細(xì)菌性痢疾和腸胃炎［8-9］，鹽酸小檗堿也是藏藥四味姜黃湯散中發(fā)揮藥效的主要成分。蒺藜中富含黃酮類和皂苷類化合物，黃酮類中的槲皮素具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞及抗動脈粥樣硬化的作用［10-11］。姜黃素是姜黃的主要有效成分之一，具有抗氧化，抗炎，尤其是抗腫瘤等生理學(xué)特性［12-13］。這3種成分與四味姜黃湯散的功效主治精密相關(guān)，因此本研究采用HPLC法同時測定這3種物質(zhì)，方法簡便、重復(fù)性好，以期提高和完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)文獻(xiàn)［2-6］，考察了多種流動相系統(tǒng)，最終發(fā)現(xiàn)0.1％磷酸溶液（每100 mL含0.15 g庚烷磺酸鈉）-乙腈組成的流動相體系，采用梯度洗脫的方法，可以達(dá)到比較好的分離效果。在波長選擇上，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿和槲皮素在360 nm、姜黃素在428 nm具有比較強(qiáng)的吸收，且雜質(zhì)干擾少，故采用可變波長的方法，測定3種物質(zhì)。

在供試品提取方法上，根據(jù)參考文獻(xiàn)，并適當(dāng)調(diào)整提取參數(shù)，比較了單用甲醇超聲提?。?］、甲醇-25％鹽酸溶液（4∶1，V/V）超聲提?。?4］、甲醇-10％鹽酸溶液（4∶1，V/V）加熱回流［15］，以及甲醇-10％鹽酸（5∶1，V/V）超聲提取的方法。結(jié)果表明，后一種方法提取效果最優(yōu)。同時，考察了提取時間，最終確定超聲提取30 min。

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網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.r.20150828.1141.002.htm1

Simultaneous determ ination of three constituents in Siwei Jianghuangtang Powder

RONG Rong1， SHEN Xiong2*， HUANG Qi-yun2*
（1.Departmentof Pharmacy，ShanghaiMental Health Center，Shanghai2OOO3O，China；2.Departmentof Pharmacy，Zhongshan Hospital Affiliated to Fudan University，Shanghai2OOO32，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish an HPLC method for simu1taneous1y determining the contents of berberine hydroch1oride，quercetin and curcumin in Siwei Jianghuangtang Powder（Curcumae Longa L.，Berberis kansuensis Schneid，Phyllanthus emblica L.and Tribulus terrester L.）.METHODS The ana1ysis of Siwei Jianghuangtang Powdermethano1-10％ hydroch1oride extractwas conducted on Phenomenex Luna-C18co1umn（250 mm×4.6 mm，5 μm）maintained at 30℃，with 0.1％（v/v）phosphoric acid-acetonitri1e in a gradient e1ution mode as themobi1e phase at a f1ow rate of1.0 mL/min.The detection wave1engthswere set at360 nm for berberine hydroch1oride and quercetin and 428 nm for curcumin.RESULTS The 1inear ranges of berberine hydroch1oride，quercetin and curcumin were 39.6 -198 μg/mL，0.326 -1.63 μg/mL and 25.6 -128 μg/mL（r≥0.999 8），respective1y. The average recoverieswere within the ranges of 96.9％ -98.9％.CONCLUSION Themethod is simp1e，sensib1e，accurate and suitab1e for the qua1ity contro1of Siwei Jianghuangtang Powder.

KEY WORDS：Siwei Jianghuangtang Powder；berberine hydroch1oride；quercetin；curcumin；high performance 1iquid chromatography（HPLC）

*通信作者：沈 熊，男，博士，副主任藥師，研究方向為藥物新劑型和新技術(shù)。E-mai1：shen.xiong@zs-hospita1.sh.cn

作者簡介：戎 蓉（1977—），女，藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)工作。E-mai1：663rr@sina.com

收稿日期：2015-04-07

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.018

中圖分類號：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）01-0088-04