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        HPLC法測定不同產(chǎn)地馬先蒿屬植物中的毛蕊花苷

        2016-04-06 09:01:10曹馨元曹文龍李茂星
        中成藥 2016年1期
        關鍵詞:產(chǎn)地

        曹馨元, 曹文龍, 陶 銳, 欒 飛, 李茂星*

        (1.蘭州大學藥學院,甘肅蘭州730000;2.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科,全軍高原環(huán)境損傷防治重點實驗室,甘肅蘭州730050;3.天祝縣藏醫(yī)藥開發(fā)研究所,甘肅武威733299)

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        HPLC法測定不同產(chǎn)地馬先蒿屬植物中的毛蕊花苷

        曹馨元1,2, 曹文龍3, 陶 銳1,2, 欒 飛2, 李茂星1,2*

        (1.蘭州大學藥學院,甘肅蘭州730000;2.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科,全軍高原環(huán)境損傷防治重點實驗室,甘肅蘭州730050;3.天??h藏醫(yī)藥開發(fā)研究所,甘肅武威733299)

        摘要:目的 建立HPLC法測定不同產(chǎn)地(甘肅、青海、四川)7種馬先蒿屬(Pedicularis L.)植物中毛蕊花苷的含有量。方法 馬先蒿屬植物75%甲醇提取液的分析采用Waters C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相甲醇-0.27%冰醋酸水溶液(35∶65);檢測波長330 nm;體積流量1 mL/min。結果 13個樣本中毛蕊花苷含有量的差異較大。其中,甘肅省武威市天堂鄉(xiāng)采集到的甘肅馬先蒿(莖、根)、中國馬先蒿、蘚生馬先蒿、俯垂馬先蒿中毛蕊花苷的含有量分別為3.62%、0.27%、6.49%、2.17%、3.47%,天??h采集到的中國馬先蒿、蘚生馬先蒿中分別為1.81%、2.26%;青海省采集到的甘肅馬先蒿、蘚生馬先蒿、白花甘肅馬先蒿中分別為3.28%、2.01%、2.45%;四川省諾爾蓋草原采集到的輪葉馬先蒿、碎米蕨葉馬先蒿、蘚生馬先蒿中分別為0.46%、1.22%、1.37%,RSD值均小于2%。結論 毛蕊花苷廣泛存在于馬先蒿屬植物中,其中甘肅馬先蒿地上部分中毛蕊花苷的含有量高于地下部分。

        關鍵詞:馬先蒿屬;毛蕊花苷;產(chǎn)地;HPLC

        馬先蒿是玄參科馬先蒿屬(Pedicularis L.)植物,關于其化學成分的研究表明[1-4],該植物中含有環(huán)烯醚萜苷[5]、苯乙醇苷[6-8]、生物堿等多種化合物,具有滋陰補腎、補中益氣、健脾和胃、清熱解毒、利尿、保肝等作用。其中,毛蕊花苷(verbascoside)屬于苯乙醇苷類化合物,主要存在于木蘭科、菊科、薔薇科、唇形科、玄參科等多種植物中,因其抗炎、抗菌、抗腫瘤、保肝、抗氧化、抗衰老、免疫調節(jié)、抗病毒、增強記憶等多種藥理作用[9],受到廣大學者的關注。作為馬先蒿屬植物的主要活性成分,建立其有效的定性定量分析方法是很有必要的。馬先蒿屬植物資源豐富,來源相對廉價,故合理的開發(fā)利用不僅有利于相關醫(yī)藥產(chǎn)品的研發(fā),也會在一定程度上促進當?shù)亟?jīng)濟的發(fā)展。有關毛蕊花苷含有量的測定方法已有較多文獻報道[10-13],本實驗首次建立了HPLC法同時測定3種產(chǎn)地7種馬先蒿屬植物中該成分的含有量,該方法簡單、快速、經(jīng)濟,能為其開發(fā)利用及品質評價提供參考,也可為其單體生物活性的進一步研究奠定基礎。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀,包括Waters 1525四元梯度泵、Waters-2998二極管陣列檢測器、Waters-2707自動進樣器、Waters-TCM柱溫箱(美國Waters公司);HP-8453紫外可見分光光度計(美國惠普公司);BP210s電子分析天平(德國Sartorius公司);SK7200H超聲波清洗器(上??茖С晝x器有限公司)。

        1.2 材料 甲醇為色譜純;水為注射用水;其他試劑均為分析純。毛蕊花苷對照品(實驗室自制,MS、NMR確定其結構,HPLC測定其純度>97.5%)。7種馬先蒿藥材于2014年8月采自甘肅、青海及四川,分別為甘肅馬先蒿Pedicularis kansuensis、中國馬先蒿P.chinensis、蘚生馬先蒿P.Muscicola、碎米蕨葉馬先蒿P.cheilanthifolia、俯垂馬先蒿P.cernua、輪葉馬先蒿P.verticillata、白花甘肅馬先蒿P.kansuensis Maxim subsp.kansuensis f.albiflora Li。

        2 方法與結果

        2.1 色譜條件 Waters C18色譜柱(4.6 mm× 150 mm,5 μm);流動相為甲醇-0.27%冰醋酸水溶液(35∶65),梯度洗脫;體積流量1 mL/min;柱溫25℃;進樣量10 μL。

        2.2 溶液的制備

        2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊花苷對照品5.00 mg,置于10 mL量瓶中,10%甲醇溶解,定容至刻度,得標準品母液。再取母液適量,10%甲醇稀釋至質量濃度為52 μg/mL,即得。

        2.2.2 供試品溶液的制備 分別取7種馬先蒿藥材適量,粉碎(過四號篩),精密稱取2 g,置于具塞錐形瓶中,精密加入75%甲醇50 mL,稱定質量,60℃回流提取30 min,冷卻,再稱定質量,75%甲醇補足減失質量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液1 mL,稀釋到10 mL量瓶中,即得。測定前,以0.45 μm微孔濾膜濾過。

        2.3 測定方法 精密量取供試品和對照品溶液10 μL,注入HPLC色譜儀,記錄色譜圖,結果見圖1。

        2.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液100、300、500、900、1 100、1 300 μL,分別定容至5 mL,進樣10 μL。以毛蕊花苷對照品溶液質量濃度(μg/mL)為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y)繪制標準曲線,得回歸方程Y=7 075.8X+ 1 396.9,r=0.999 8。結果表明,毛蕊花苷在1.3~169 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

        2.5 方法學考察

        2.5.1 精密度試驗 取毛蕊花苷對照品溶液適量,在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6次。結果,RSD為0.68%,表明儀器精密度良好。

        2.5.2 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液,室溫下分別于0、2、4、6、12、24 h進行測定。結果顯示,各樣品峰面積的RSD分別為2.0%、0.89%、1.3%、0.72%、1.8%、2.1%、0.89%、1.9%、1.5%、0.93%、0.40%、0.27%、1.4%,表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

        2.5.3 重復性試驗 取各藥材粉末適量,按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液,在“2.1”項色譜條件下測定。結果,各樣品中毛蕊花苷的RSD分別為1.91%、3.35%、1.15%、1.85%、1.03%、1.76%、3.61%、2.22%、2.13%、1.17%、2.65%、1.72%、0.59%,表明該方法重復性良好。

        2.5.4 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的甘肅馬先蒿6份,每份0.75 g,加入16.9 mg/mL對照品溶液500 μL,按“2.2.2”項下方法制備樣品溶液,在“2.1”項色譜條件下平行測定,記錄色譜圖,并計算加樣回收率,結果見表1。

        1.毛蕊花苷1.verbascoside圖1 HPLC色譜圖 Fig.1 HPLC chromatogram s

        2.5.5 含有量測定 精密稱取7種藥材粉末3份,每份2 g,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,在“2.1”項色譜條件下分析,結果見表2。

        表1 加樣回收試驗結果Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

        表2 馬先蒿樣品中毛蕊花苷含有量(n=6)Tab.2 Content of verbascoside in Pedicularis L.samp les (n=6)

        3 討論

        3.1 流動相的選擇 毛蕊花苷是苯乙醇苷類化合物,具有多個酚羥基,在酸性條件下穩(wěn)定性較好。本實驗考察了不同比例的乙腈-水、甲醇-水系統(tǒng)作為流動相的效果,最終確定色譜條件為甲醇-0.27%冰醋酸水溶液=35∶65。

        3.2 檢測波長的選擇 毛蕊花苷化學結構復雜,具有多個共軛雙鍵,經(jīng)紫外分光光度計全波長掃描,測得其最大吸收波長為330 nm,并以此作為檢測波長。

        3.3 樣品制備 在供試品制備方法上,本實驗考察了75%甲醇及水對毛蕊花苷提取效率的影響,發(fā)現(xiàn)以前者為提取溶劑時效率最高。在此基礎上,又比較了熱回流和超聲對提取結果的影響,發(fā)現(xiàn)前者提取效率高。因此,確定以75%甲醇熱回流提取30 min為供試品制備方法,既簡便可靠,又不會造成有效成分的破壞。

        3.4 資源利用 本實驗采用HPLC法測定了7種不同馬先蒿植物中毛蕊花苷的含有量,并以其為指標,考察了不同產(chǎn)地及品種馬先蒿的品質差異。結果顯示,7種馬先蒿植物莖葉中均含有毛蕊花苷,但含有量有差異,甘肅馬先蒿地上部分中毛蕊花苷的含有量高于地下部分,這為進一步保護資源、開發(fā)擴大用藥部位及資源的可持續(xù)利用提供了科學依據(jù)。而且,不同地區(qū)海拔、氣候等原因均可造成藥材中目標成分含有量的差異,本實驗比較了3個省份馬先蒿中毛蕊花苷的含有量,可為藥材品質評價及該成分生物活性的深入研究奠定基礎。

        參考文獻:

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        [2] 郭偉杰.藏藥甘肅馬先蒿化學成分及抑菌活性研究[D].蘭州:蘭州理工大學,2014.

        [3] 張 琳,邵 赟,趙曉輝,等.藏藥斑唇馬先蒿的化學成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2013,25(1):40-43.

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        Determ ination of verbascoside in plants of Pedicularis L.from different grow ing areas by HPLC

        CAO Xin-yuan1,2, CAOWen-1ong3, TAO Rui1,2, LUAN Fei2, LIMao-xing1,2*
        (1.School of Pharmacy,Lanzhou University,Lanzhou 73OOOO,China;2.Departmentof Pharmacy,Lanzhou General Hospital of PLA;Key Laboratory of Prevention and Cure for Plateau Environment Damageof PLA,Lanzhou 73OO5O,China;3.Tianzhu County DevelopmentResearch Institute for Tibetan Medicine,Wuwei733299,China)

        ABSTRACT:AIM To estab1ish an HPLCmethod for determining verbascoside in seven kinds of p1ants of Pedicularis L.from differentgrowing areas(Gansu,Qinghaiand Sichuan).M ETHODS The ana1yses of p1ants of Pedicularis L.75% methano1ic extractswere performed on Waters C18co1umn(4.6 mm×150 mm,5 μm),mobi1e phase was MeOH-0.27% g1acia1acetic acid(35∶65),detection wave1ength was set at 330 nm,f1ow rate was 1 mL/min.RESULTS Therewere obvious differences in verbascoside content in thirteen samp1es.Among them,those in P.kansuensis(stems and roots),P.chinensis,P.muscicola and P.cernua in Tiantang(Wuwei,Gansu)were 3.62%,0.27%,6.49%,2.17% and 3.47%,those in P.chinensis and P.muscicola in Tianzhu were 1.81% and 2.26%,those in P.kansuensis,P.muscicola and P.kansuensis Maxim subsp.kansuensis f.albiflora Li(Qinghai)were 3.28%,2.01% and 2.45%,and those in P.verticillata,P.cheilanthifolia and P.muscicola in Nouergai prairie(Sichuan)were 0.46%,1.22% and 1.37%,respective1y.A11the RSDswere 1ess than 2%. CONCLUSION Verbascoside is wide1y distributed in p1ants of genus Pedicularis,whose content in the above-book=127,ebook=133ground part is higher than that in the under-ground part of P.Kansuensis.

        KEY WORDS:Pedicularis L.;verbascoside;growing areas;HPLC

        *通信作者:李茂星(1973—),男,博士,副主任藥師,從事中藥新藥研究與開發(fā)。Te1:(0931)8994676,E-mai1:1imaox2005@ a1iyun.com

        作者簡介:曹馨元,碩士,從事天然藥物化學、中藥新藥研究與開發(fā)。Te1:(0931)8994676,E-mai1:caoxy14@1zu.edu.cn

        基金項目:國家自然科學基金面上項目(81374019);甘肅省中醫(yī)藥管理局課題(GZK-2015-59);全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研項目(CLZ15JA05)

        收稿日期:2015-03-20

        doi:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.028

        中圖分類號:R284.1

        文獻標志碼:A

        文章編號:1001-1528(2016)01-0126-05

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