郭 露，李友誼，段成霞，呂紅彬

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，四川瀘州 646000）

VEGF-2578C/A基因多態(tài)性與糖尿病性視網(wǎng)膜病變發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系*

郭 露，李友誼，段成霞，呂紅彬

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，四川瀘州 646000）

目的：研究VEGF-2578C/A基因多態(tài)性與糖尿病性視網(wǎng)膜病變（DR）的關(guān)系。方法：按照國際糖尿病性視網(wǎng)膜病變?cè)\斷標(biāo)準(zhǔn)隨機(jī)選取我院門診及住院部2型DR患者158例（DR組）、2型糖尿病患者104例（T2DM組），并隨機(jī)選擇門診體檢的健康個(gè)體164例作為對(duì)照組。分別抽取肘靜脈血9ml，6ml送檢相關(guān)指標(biāo)，其余3ml用于提取全血DNA。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性 （PCR-RFLP）法檢VEGF-2578C/A基因型及基因頻率，并記錄糖化血紅蛋白（GlyoohemoglobinA1c, HbA1c）、體重指數(shù)（Body Mass Index,BMI）、總膽固醇（Total Cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）等臨床及生化指標(biāo).結(jié)果：1、DR組與T2DM組患者的BMI、HbA1c、TC和TG的指標(biāo)均明顯高于正常組 （P<0.05）；DR組與T2DM組HbA1c差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）；2、DR組與正常對(duì)照組比較：DR組CC基因型所占比例明顯較正常對(duì)照組比例高，結(jié)果示CC基因型為正常人發(fā)展成為DR的危險(xiǎn)基因（χ2=7.59,P=0.01），AA基因型為其保護(hù)基因（χ2=15.94,P=0.00）；3、T2DM組與正常對(duì)照組無明顯差異 （P>0.05）；4、DR組與T2DM組比較結(jié)果示C等位基因?yàn)門2DM患者發(fā)展成為DR患者的危險(xiǎn)基因（χ2=4.74,P=0.03），而AA基因型為其保護(hù)基因（χ2=4.07,P=0.04）。多因素Logistic回歸分析結(jié)果示CC基因型、糖化血紅蛋白是正常人發(fā)展為DR的危險(xiǎn)因素。結(jié)論：DR的發(fā)生可能不僅僅與血糖相關(guān)，同時(shí)還受到了其他因素的綜合影響；中國瀘州地區(qū)漢族VEGF-2578C/A基因多態(tài)性與DR相關(guān)，C等位基因?yàn)門2DM患者發(fā)展為DR的危險(xiǎn)因素，而CC基因型可能是發(fā)展為DR的暴露基因型，AA基因型為其保護(hù)基因型。

基因多態(tài)性；糖尿病性視網(wǎng)膜病變；血管內(nèi)皮生長因子；危險(xiǎn)因素

糖尿病性視網(wǎng)膜病變 （diabetic retinopathy, DR）無論是在眼科還是內(nèi)分泌科均是非常棘手且預(yù)后很差的疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)糖尿病患者無論是1型還是2型幾乎均會(huì)在15年內(nèi)發(fā)展成為不同程度的DR[1]。目前世界衛(wèi)生組織發(fā)布消息稱，將把DR的預(yù)防以及治療作為世界第二大防盲重點(diǎn)眼病[2]。DR作為一個(gè)多因素共同作用的疾病[3]，不僅與患者血糖、血壓的控制有關(guān)，還存在明顯家族聚集現(xiàn)象，不同人種、地區(qū)其發(fā)病率也有明顯差異，比如亞洲人和歐洲人，外來的影響可能隨著環(huán)境的改變而變化，而基因的影響卻很少被外界所干擾，此外，我們還發(fā)現(xiàn)，即便是同一類型的DR，不同人發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)也不盡相同。因此，越來越多的研究者關(guān)注點(diǎn)開始由病理生理水平轉(zhuǎn)向了基因水平的研究[4-6]。

血管內(nèi)皮生長因子 （vascular endothelial growth factor,VEGF）是DR發(fā)生發(fā)展中重要的致病因子，研究發(fā)現(xiàn)在DR患者血清、玻璃體中VEGF水平較正常人明顯升高，而通過對(duì)大量國內(nèi)外研究進(jìn)行Meta分析發(fā)現(xiàn)[7]，VEGF-2578C/A基因多態(tài)性與DR的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但不同地區(qū)的研究結(jié)果卻存在差異，為此我們推測(cè)，不同種族、人群DR患者-2578C/A基因內(nèi)可能含有使VEGF表達(dá)水平變化的基因變異，而國內(nèi)對(duì)此基因研究較少，因此，針對(duì)中國瀘州地區(qū)DR患者我們進(jìn)行了相關(guān)研究。

1 研究對(duì)象及方法

1.1 研究對(duì)象

按照國際糖尿病性視網(wǎng)膜病變?cè)\斷標(biāo)準(zhǔn)及世界衛(wèi)生組織 （WHO）1999年提出的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)選取來自我院2014年5月至2015年10月門診及住院部患者262例納入本次研究，其中，DR患者158例 （DR組），2型糖尿病 （Type 2 diabetes mellius, T2DM）患者104例（T2DM組），同時(shí)抽取我院門診健康體檢者164例作為對(duì)照組，所有對(duì)象均排除其他器官急慢性病史及妊娠婦女，均為中國漢族，彼此無親緣關(guān)系。

1.2 研究方法

抽取研究對(duì)象肘靜脈血9ml，其中3ml用于基因檢測(cè)DNA的提取，其余6ml送檢測(cè)總膽固醇（Total Cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、糖化血紅蛋白（GlyoohemoglobinA1c,HbA1c），用酚／氯仿抽提法提取全血DNA，根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫及查閱相關(guān)VEGF-2578C/A文獻(xiàn)，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，并由美國NEB公司合成，上游：5’-GCCTTAGGACACCATACCGATG-3’，下游：5’-GCTGCCCCAGGGAACAAAGTTG-3’，運(yùn)用PCRRFLP法擴(kuò)增產(chǎn)物后進(jìn)行酶切，在紫外線凝膠成像系統(tǒng)下最終可得到285bP、206bP、79bP三種片段。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS18.0軟件包進(jìn)行。檢驗(yàn)所有基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡；對(duì)各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及臨床檢查數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布的資料用（±s）表示，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)；兩組間的計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)；兩組以上的計(jì)量資料比較用方差分析；用Logistic回歸分析法分析發(fā)生DR的危險(xiǎn)性。以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

對(duì)各組基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，DR組χ2＝0.04,P＝0.83;T2DM組χ2＝1.05,P＝0.30；正常對(duì)照組χ2＝0.11,P＝0.74，所有研究對(duì)象均P＞0.05說明樣本來自同一孟德爾群體。

2.2 各組臨床基本數(shù)據(jù)檢驗(yàn)

表1中我們可以看出，相比正常組，DR組與T2DM組患者無論是BMI、HbA1c、TC還是TG的指標(biāo)均明顯高于正常組（P＜0.05），DR患者其HbA1c雖明顯升高，但卻低于T2DM患者，且其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

2.3 各組基因型間的統(tǒng)計(jì)分析

從表2可以看出，三組對(duì)象VEGF-2578C/A均存在CC、AA、CA三種基因型，將各組基因型及等位基因進(jìn)行比較分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2＝ 11.01,P＝0.02；χ2＝10.68,P＝0.00），將三組基因兩兩比較結(jié)果示：①DR組與正常對(duì)照組比較：DR組CC基因型所占比例明顯較正常對(duì)照組比例高，結(jié)果示CC基因型為正常人發(fā)展成為DR的危險(xiǎn)基因 （χ2＝7.59,P＝0.01），AA基因型為其保護(hù)基因（χ2＝15.94,P＝0.00）;②T2DM組與正常對(duì)照組無明顯差異（P＞0.05）;③DR組與T2DM組比較結(jié)果示C等位基因?yàn)門2DM患者發(fā)展成為DR患者的危險(xiǎn)基因（χ2＝4.74,P＝0.03），而AA基因型為其保護(hù)基因（χ2＝4.07,P＝0.04）。最后用多因素Logistic回歸分析結(jié)果示CC基因型、糖化血紅蛋白是正常人發(fā)展為DR的危險(xiǎn)因素（表3）。

表1 各組研究對(duì)象基本信息之間的比較

表2 各組基因型及等位基因的數(shù)據(jù)及百分比比較

3 討 論

DR作為具有較高致盲率的嚴(yán)重眼病，其眼底的改變主要包括血管通透性增加、組織缺血、新生血管的形成、軟硬性滲出以及不同程度的出血，牽引性視網(wǎng)膜脫離等[8-9]，迄今為止仍然沒有能夠完全治愈DR的方法。大量研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-2578C/A基因多態(tài)性主要由位于啟動(dòng)區(qū)2549區(qū)的大小約18bp的片段插入、缺失所決定。當(dāng)存在2549片段插入時(shí)，則其堿基表現(xiàn)為A，若該片段缺失時(shí)則表現(xiàn)為C[10]。人類VEGF基因5’側(cè)翼區(qū)呈高度的多態(tài)性，且與VEGF表達(dá)水平相關(guān)，Shahbaazi等[11]針對(duì)啟動(dòng)區(qū)2549區(qū)片段的不同也進(jìn)行了相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，正常人中，VEGF-2578CC純合子的人體內(nèi)VEGF水平明顯高于VEGF-2578AA純合子，而VEGF-2578C／A雜合子的人其 VEGF表達(dá)水平居中，進(jìn)一步說明了VEGF啟動(dòng)區(qū)2549區(qū)片段的差異與VEGF表達(dá)水平相關(guān)。然而，該區(qū)域內(nèi)片段插入、缺失又存在種族差異，張英爽等[12]對(duì)不同種族健康人VEGF-2578C/A進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)中國漢族VEGF-2578C/A各基因型頻率分布中，CC為48.8%，CA為46.0%，AA為5.2%，其C等位基因?yàn)?1.8%，A等位基因?yàn)?8.2%，與歐洲人相比呈現(xiàn)明顯差異，且歐洲AA基因型純合子所占比例明顯高于中國漢族，而這一觀點(diǎn)與我們?cè)诒?中所列的研究結(jié)果較一致。我們對(duì)2014年4月之前所有關(guān)于歐洲人及亞洲人VEGF-2578C/A基因多態(tài)性的研究進(jìn)行了 Meta分析，結(jié)果示歐洲人VEGF-2578A等位基因是DR發(fā)生的危險(xiǎn)基因，而亞洲人分析結(jié)果示VEGF-2578C/A與DR的關(guān)系各結(jié)論并不一致，沒有表現(xiàn)出明顯趨勢(shì)[7]。因此，除了研究國內(nèi)外DR患者VEGF-2578C/A基因多態(tài)性與其發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，我們更加需要大量針對(duì)我國各個(gè)民族及地區(qū)不同人群的大樣本研究，才更具有說服力。

DR不僅與血糖、血脂及血壓等因素有關(guān)，還受環(huán)境、基因的影響，表1中DR組與T2DM組患者無論是BMI、HbA1c、TC還是TG的指標(biāo)均明顯高于正常組（P＜0.05），說明了T2DM及DR往往會(huì)同時(shí)與其他慢性疾病共存，這也增加了研究難度，表中我們還能看出，DR患者其HbA1c雖明顯升高，但卻低于T2DM患者，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），該現(xiàn)象與我們過去所知血糖控制不佳是糖尿病患者發(fā)展為DR等嚴(yán)重微血管并發(fā)癥的重要原因的結(jié)論有所不同，出現(xiàn)這種差異的原因可能是我們所研究的T2DM患者中存在首次明確診斷的患者，其血糖從未進(jìn)行過正規(guī)的控制，往往HbA1c指標(biāo)也比較高，而DR患者大部分為經(jīng)過了正規(guī)治療的復(fù)查患者，該現(xiàn)象也進(jìn)一步說明了DR的發(fā)生可能不僅僅與血糖相關(guān)，同時(shí)還受到了其他因素的影響等。研究中我們對(duì)所有DR患者組、T2DM患者組及正常對(duì)照組的基因型及等位基因數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表2），結(jié)果表明DR組與T2DM組及正常對(duì)照組間有差異，而T2DM組與正常對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在DR組與正常對(duì)照組比較可以看出，其CC基因型可能為其危險(xiǎn)基因，但C等位基因是否為正常人發(fā)展為DR的危險(xiǎn)等位基因卻不能證明；在DR組與T2DM組等位基因比較中可以看出，C等位基因?yàn)槠湮ｋU(xiǎn)基因，AA基因型為其保護(hù)基因，而CC基因型可能為T2DM發(fā)展為DR的暴露因素；以上統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)與Shahbaazi等[11]研究結(jié)論一致。表3中我們將有無DR作為因變量，CC基因型、糖化血紅蛋白、年齡、BMI、膽固醇、甘油三酯作為自變量，用多因素Logistic回歸分析研究各因素對(duì)DR發(fā)病的影響，結(jié)果示CC基因型、糖化血紅蛋白是正常人發(fā)展為DR的危險(xiǎn)因素。

通過搜索瀏覽國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)及對(duì)其進(jìn)行Meta分析[7]，我們發(fā)現(xiàn)大部分歐洲人及部分亞洲、甚至國內(nèi)研究者的研究結(jié)果提示VEGF-2578A等位基因是DR發(fā)生的危險(xiǎn)基因，與本次研究結(jié)論有差異，出現(xiàn)此差異的可能原因包括：①人種、民族、環(huán)境的差異，DR是一個(gè)多基因及環(huán)境綜合影響的疾病，易受不同生活環(huán)境等因素的影響；②本次研究樣本量還不足夠大，其結(jié)論僅能做一個(gè)趨勢(shì)的參考，而不具備證明某一結(jié)論的能力；③正常對(duì)照組為來院健康體檢患者的隨機(jī)樣本，大部分為公司職員或企業(yè)職工，極少部分為低收入人群、農(nóng)民等，因此存在一定程度的選擇偏移。我們?nèi)孕柽M(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，以得出更確切的趨勢(shì)。

表3 正常人發(fā)生DR的危險(xiǎn)因素分析

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（2016-04-26收稿）

Association of VEGF-2578C/A gene polymorphism with the risk for diabetic retinopathy

Guo Lu,Li Youyi，Duan Chengxi，Lu Hongbing.
Department of Ophthalmology,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan province 646000,China

Objective:This study aimed to investigate the association of VEGF-2578C/A SNPs and the risk for DR in Chinese Han population.Methods:A total of 426 patients and healthy people were randomly recruited from The Affiliated Hospital of Southwest Medical University and its surrounding counties from May 2014 to Oct 2015,which included 158 cases of type 2 diabetic retinopathy （DR）,104 cases of type 2 diabetes mellitus（T2DM）,and 164 cases of healthy people（control）.The diagnostic criterions of diabetes were the standard of WHO and the international diagnose of diabetic retinopathy standards.Nine ml blood was taken from the elbow vein of each subject.Of the 9 ml of blood,3 ml was used to extract DNA,and the rest 6 ml was sent to clinical laboratory for biochemistry and HbA1c test.The VEGF-2578C/A polymorphisms was detected by Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism analysis（PCR-RFLP）.The biochemical data such as HbA1c,BMI,TC and TG were recorded at the same time.All data were analysed by SPSS18.0 software.The distribution of VEGF genotype was analysed by Chi-square analysis to test whether it fitted the Hardy-Weinbergequilibrium.Normally distributed data were presented as means±SD （±s）.Non-normally distributed data were presented as median（quartile range）.Measurable data between the two groups were compared using t or t’-test, three or more groups were compared using variance analysis;Numeric data were compared using Chi-square analysis.Risk factors for type 2 diabetic retinopathy were analyzed using multiple logistic regression analysis. .Results::Statistical analysis showed that DR and T2DM group had significantly higher HbA1c,BMI、TC、TG than the control group（P＜0.05）;VEGF-2578 C allele is significantly different between DR and T2DM groups（χ2＝4.74,P＝0.03）;VEGF-2578 CC alleles are the reason for the health people to develop DR （χ2＝7.59,P＝0.01）, and AA alleles maybe the protective factor for the healthy and patients with type 2 diabetes（χ2＝15.94,P＝0.00; χ2＝4.07,P＝0.04）.The multiple logistic regression analysis shows CC alleles and HbA1c are risk factors for the healthy people to develop DR.Conclusion::VEGF-2578C/A is associated with DR in Han Chinese in Luzhou, Sichuan,VEGF-2578 C allelic gene is the risk factor for type 2 diabetes mellitus to develop diabetic retinopathy，and VEGF-2578 CC gene type is the risk factor and AA gene type is the protective factor of DR in Han Chinese in Luzhou,Sichuan.

Genetic polymorphism;Diabetic retinopathy;Vascular endothelial growth factor;Risk factor

R774.1

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.03.009

*四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015SZ0086），四川省科技廳-瀘州市-瀘州醫(yī)學(xué)院項(xiàng)目，（14JC01723-LH36）作者簡介：郭 露（1989-），女，醫(yī)師，碩士

呂紅彬（1966-），女，教授，博士，E-mail:coulistlvhongbin@163.com