王 肖 冰，　劉 春 瑩，　王 　 上，　魚 紅 閃，　金 鳳 燮

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連　116034 )

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生物轉(zhuǎn)化制備紅參Rh1皂苷組及成分分析

王 肖 冰，劉 春 瑩，王 上，魚 紅 閃，金 鳳 燮

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連116034 )

摘要:利用TLC和超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)分析已制備的Rh1組異構(gòu)體，利用HPLC分析其異構(gòu)體的質(zhì)量比。Rh1組在TLC圖譜中顯2個(gè)斑點(diǎn)，經(jīng)UPLC-MS的分析，確認(rèn)紅參皂苷Rh1組含有4種異構(gòu)體，分別是20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3和Rh4；高效液相色譜檢測結(jié)果表明紅參皂苷Rh1組中4種異構(gòu)體20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4的質(zhì)量比為25.0∶18.8∶15.5∶40.7，4種異構(gòu)體總質(zhì)量分?jǐn)?shù)在90%以上。

關(guān)鍵詞:紅參皂苷Rh1組；異構(gòu)體；高效液相色譜；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

0引言

人參為五加科多年生植物的干燥塊根和莖，其根莖均可入藥[1]。人參皂苷Rh1組由20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4等4種異構(gòu)體所組成，且Rh1組皂苷由于4種異構(gòu)體的協(xié)同作用，活性遠(yuǎn)高于Rh1單體[2]。Rh1具有抗腫瘤、抑制癌細(xì)胞的作用[3-4]，可誘導(dǎo)癌細(xì)胞的分化逆轉(zhuǎn)[5]，有抑制體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞生長速度和分裂能力的作用[6]。人參皂苷Rh1組還有很強(qiáng)的保護(hù)肝細(xì)胞、保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞、防止老年癡呆、增強(qiáng)機(jī)體對病毒的抵抗力等療效[7-9]。

生曬人參中，80%以上的人參皂苷為20(S)的Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Re、Rg1[10]，這些皂苷活性低、吸收率低，總皂苷平均吸收率只有5%[11-12]。但是紅參稀有皂苷Rg3、Rh2、Rg2、Rh1，Rg5和Rk1，Rh3和Rk2，Rg4(F4)和Rg6，Rh4和Rk3吸收率高，具有很好的生理功能[13-14]。

紅參加工過程中，在人參自身的酶、其他物質(zhì)的作用下，主要人參皂苷為20(S)的Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Re、Rg1的20(S)-O-R2的糖基水解，生成20(S)-OH和20(R)-OH的Rg3、Rh2、Rg2、Rh1、Rs3皂苷的兩種異構(gòu)體[15]；20(S)-OH和20(R)-OH 的皂苷進(jìn)一步脫水形成反式、順式異構(gòu)體Rg5和Rk1、Rh3和Rk2、Rg4(F4)和Rg6、Rh4和Rk3、Rs4和Rs5[16]；但是Rs皂苷失掉有機(jī)酸基，穩(wěn)定的紅參皂苷共16種，可分為4種異構(gòu)體的Rg3組、Rg2組、Rh2組、Rh1組[17]；這些紅參皂苷群在傳統(tǒng)紅參中的含量很低，而且Rg3組、Rg2組、Rh2組、Rh1組的16種皂苷交織在一起，無法從紅參中分離提取紅參皂苷[18]。

為此，本實(shí)驗(yàn)室田桐等[19]研究了Rg3組的制備和分離；劉飛等[20]研究了生物轉(zhuǎn)化制備Rg2組；何丹[21]研究了F2制備并由F2制備Rh2組。本實(shí)驗(yàn)主要研究了生物轉(zhuǎn)化制備的Rh1組成分。

1試驗(yàn)

1.1材料與儀器

人參皂苷20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3和Rh4混合物標(biāo)準(zhǔn)品，由本實(shí)驗(yàn)室提供；紅參皂苷Rh1組，本實(shí)驗(yàn)室制備。

薄層層析板Silica gel 60-F254，德國Merck公司；高效液相色譜儀，美國Waters公司；超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Waters公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1薄層層析法(TLC)

用刻度毛細(xì)管吸取標(biāo)準(zhǔn)品及樣品，點(diǎn)樣于薄層層析板上。展開劑配比按氯仿-甲醇-水體積比7∶2.5∶0.5，10%硫酸加熱顯色。

1.2.2超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)

色譜柱，BEH shield RP18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。流動(dòng)相為0.1%甲酸-乙腈(A)與0.1% 甲酸-水(B)混合物。梯度洗脫：0～5 min，5%～95% A線性梯度；5～10 min，95% A等度。進(jìn)樣量，10 μL；體積流量，0.5 mL/min；柱溫，30 ℃；檢測波長，203 nm。

毛細(xì)管電壓，2.5 kV；樣品孔電壓，35 V；離子源溫度，100 ℃，脫溶劑氣溫度，350 ℃；錐孔氣體積流量，50 L/h，脫溶劑氣體積流量，1 000 L/h；質(zhì)量掃描范圍，100～1 000 Da。

1.2.3高效液相色譜法

Waters 2996二極管陣列檢測器及Empower色譜工作站；Knauer C18色譜柱(5 μm，250 mm×3 mm)；樣品進(jìn)樣量，10 μL；柱溫，35 ℃；體積流量，0.6 mL/min；檢測波長，203 nm；乙腈(A)-水(B)梯度洗脫：0～20 min，20% A等度；20～31 min，20%～32% A線性梯度；31～40 min，32%～43% A線性梯度；40～70 min，43%～100% A線性梯度。

2結(jié)果與討論

2.1Rh1組的薄層層析(TLC)檢測結(jié)果

利用薄層層析法(TLC)初步分析紅參皂苷Rh1組異構(gòu)體組成，結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看到，Rh1組有2個(gè)斑點(diǎn)，上斑點(diǎn)可能為Rk3和Rh4重疊，顯示為一個(gè)斑點(diǎn)；下斑點(diǎn)可能為20(S)-Rh1和20(R)-Rh1重疊，顯示為一個(gè)斑點(diǎn)。TLC檢測結(jié)果初步證明，Rh1組產(chǎn)品中可能含有4種異構(gòu)體20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3和Rh4。

1，Rg1；2，Rh1標(biāo)準(zhǔn)品；3，Rk3、Rh4混合物標(biāo)準(zhǔn)品；

2.2超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)分析Rh1組分

采用超高效液相色譜法對Rh1組人參稀有皂苷進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出，Rh1組有4個(gè)明顯的紫外吸收峰，其保留時(shí)間依次為2.92，2.98，3.64，3.71 min，與人參稀有皂苷20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3和Rh4標(biāo)準(zhǔn)品的UPLC譜圖一致，說明Rh1組產(chǎn)品中含有這4種人參皂苷成分。

采用串聯(lián)質(zhì)譜法對Rh1組的4種人參皂苷的相對分子質(zhì)量進(jìn)行測定。在負(fù)離子模式下，串聯(lián)質(zhì)譜(Q/TOF)檢測得到Rh1組樣品的總離子流圖，如圖3所示。從圖3中可以看出，Rh1組中4種人參皂苷在總離子流圖中的保留時(shí)間依次為2.95，3.02，3.68，3.74 min，與UPLC圖中各組分的保留時(shí)間相符。

再通過對總離子流峰進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，確定Rh1組樣品中各物質(zhì)的相對分子質(zhì)量。首先對ESI-模式下的Rh1組中保留時(shí)間為2.95和3.02 min 的人參稀有皂苷的離子峰進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，如圖4所示。

圖3　ESI-模式下Rh1組樣品總離子流圖譜

(a) 20(S)-Rh1

(b) 20(R)-Rh1

圖420(S)-Rh1和20(R)-Rh1在ESI-模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖

Fig.4Thechromatogramoflevel1of20(S)-Rh1and20(R)-Rh1inESI-mode

從圖4可以看出，這2種人參稀有皂苷在ESI-模式下通過Q/TOF均得到離子峰m/z=683。該離子峰為[Rh1+HCOOH]-離子峰，而負(fù)離子模式下又減少一個(gè)H；因此，這2種物質(zhì)的相對分子質(zhì)量均為638，與人參稀有皂苷20(S)-Rh1和20(R)-Rh1的相對分子質(zhì)量相同。由此證明，Rh1組中含有人參稀有皂苷20(S)-Rh1和20(R)-Rh1。

再對ESI-模式下的Rh1組人參稀有皂苷中保留時(shí)間為3.68和3.74min的離子峰進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，如圖5所示。

皂苷名稱保留時(shí)間/min面積面積比/%20(S)-Rh138.966407446725.0120(R)-Rh139.517306293318.80Rk346.194253012815.53Rh446.932662317340.66

(a) Rk3

(b) Rh4

圖5Rk3、Rh4在ESI-模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖

Fig.5Chromatogram of level 1 of Rk3 and Rh4 in

ESI-mode

從圖5可以看出，這2種人參稀有皂苷在ESI-模式下通過Q/TOF均得到離子峰m/z=665。該離子峰為[Rk3+HCOOH]-離子峰，而負(fù)離子模式下又減少一個(gè)H；因此，這2種物質(zhì)的相對分子質(zhì)量均為620。與人參稀有皂苷Rk3和Rh4相對分子質(zhì)量相同。由此證明，Rh1組樣品中含有人參稀有皂苷Rk3和Rh4。

由圖4和5可知，Rh1組中含有預(yù)測的4種人參稀有皂苷異構(gòu)體20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4。

2.3高效液相色譜分析Rh1組分

利用HPLC確定Rh1組中4種異構(gòu)體或質(zhì)量比，結(jié)果如圖6所示。

圖6　紅參皂苷Rh1組的HPLC檢測圖譜

從圖6中可以看出，Rh1組中有4種人參皂苷，通過與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對照，可初步判斷Rh1組中含有人參皂苷20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4；保留時(shí)間依次為38.966，39.517，46.194，46.932 min；4種異構(gòu)的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)在90%以上，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1　Rh1組HPLC圖的數(shù)據(jù)分析

Tab.1　Data analysis of Rh1 group in HPLC

從圖6、表1中可以看出，Rh1組中含有4種人參皂苷20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4，質(zhì)量比為25.0∶18.8∶15.5∶40.7。

3結(jié)論

紅參皂苷Rh1組在TLC圖譜中有2個(gè)斑點(diǎn)，推測上斑點(diǎn)可能為Rk3和Rh4皂苷的混合物，下斑點(diǎn)可能為20(S)-Rh1和20(R)-Rh1異構(gòu)體的混合物；經(jīng)UPLC-MS分析，進(jìn)一步確認(rèn)紅參皂苷Rh1組含有4種異構(gòu)體，分別是20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3和Rk4；高效液相色譜檢測結(jié)果表明，紅參皂苷Rh1組中4種異構(gòu)體20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4的質(zhì)量比為25.0∶18.8∶15.5∶40.7，4種異構(gòu)體總質(zhì)量分?jǐn)?shù)在90%以上。

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Preparation and analysis of ginsenoside Rh1 products from biotransformation

WANGXiaobing,LIUChunying,WANGShang,YUHongshan,JINFengxie

( School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Abstract:After analysis using TLC, UPLC-MS and HPLC, Rh1 group showed two bands in TLC plate, one of which might be a mixture of Rk3 and Rh4 saponins, and other of which might be a mixture of 20(S)-Rh1 and 20(R)-Rh1. UPLC-MS showed that the red ginseng ginsenoside Rh1 group contained four isomers such as 20(S)-Rh1, 20(R)-Rh1, Rk3 and Rk4, the mass fraction of which was 25.0∶18.8∶15.5∶40.7. The total mass fraction in the Rh1 products was more than 90%.

Key words:ginsenoside Rh1 group; isomers; HPLC; UPLC-MS

作者簡介:王肖冰(1991-)，女，碩士研究生；通信作者：金鳳燮(1945-)，男，教授.

基金項(xiàng)目:國家科技重大專項(xiàng)“新藥研究開發(fā)關(guān)鍵技術(shù)研究”(2012ZX09503001-003).

收稿日期:2014-12-23.

中圖分類號(hào):TS201.2；Q284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1674-1404(2016)01-0011-04