郝 建 云，　陶 　 冶，　劉 詩 文，　肖 　 珊，　王 　 晗，　王 際 輝

( 大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連　116034 )

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嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素培養(yǎng)條件的優(yōu)化

郝 建 云，陶 冶，劉 詩 文，肖 珊，王 晗，王 際 輝

( 大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連116034 )

摘要:為了提高嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的產(chǎn)量，通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的培養(yǎng)條件。采用瓊脂擴(kuò)散法測定含有細(xì)菌素的發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌的抑菌活性，根據(jù)抑菌圈的大小，確定最適培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件。試驗(yàn)結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素最佳培養(yǎng)基組分為：蛋白胨10 g/L，牛肉膏12.5 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖15 g/L，檸檬酸氫三銨2 g/L，無水乙酸鈉5 g/L，碳酸鈣1 g/L，K2HPO4·3H2O 2.62 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，MnSO4·H2O 0.25 g/L，Tween-80 3 mL/L。最佳發(fā)酵條件為初始pH 6.3、37 ℃、接種量3%、培養(yǎng)時(shí)間22 h。此條件下，抑菌圈直徑可達(dá)22.4 mm。

關(guān)鍵詞:嗜酸乳桿菌；細(xì)菌素；條件優(yōu)化；抑菌活性

0引言

乳酸菌是目前世界上公認(rèn)安全的食品級(jí)微生物，能產(chǎn)生具有抑菌或殺菌效果的有機(jī)酸、過氧化氧、雙乙酰和細(xì)菌素[1-2]。其中，細(xì)菌素是乳酸菌發(fā)揮益生作用的主要物質(zhì)[3]。細(xì)菌素是細(xì)菌在生長過程中通過核糖體途徑合成并分泌到環(huán)境中的具有抑菌作用的蛋白或多肽物質(zhì)，具有高效、無毒、耐高溫、無殘留、無抗藥性等優(yōu)點(diǎn)[4]，產(chǎn)生菌對(duì)其細(xì)菌素具有自身免疫性，在抑制多種病原微生物和食物腐敗菌等方面具有重要作用[5-6]。

1969年，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)聯(lián)合食品添加劑專家委員會(huì)將乳酸乳球菌乳酸亞種產(chǎn)生的細(xì)菌素 Nisin批準(zhǔn)為食品添加劑，細(xì)菌素受到廣大科學(xué)工作者的廣泛關(guān)注[7]，逐漸成為食品、醫(yī)藥、畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)等行業(yè)的研究熱點(diǎn)[8]。但Nisin抑菌譜較窄，只對(duì)近緣關(guān)系的革蘭陽性乳酸菌和非乳酸菌有抑制作用，對(duì)革蘭陰性細(xì)菌和真菌無效[9]。同時(shí)，其較低的產(chǎn)量也制約著細(xì)菌素的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用，成為細(xì)菌素商業(yè)應(yīng)用的瓶頸[10-11]。

近幾年研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素在抑菌方面具有廣譜性，不僅可抑制革蘭氏陽性菌，也可抑菌革蘭陰性菌和真菌[12-13]。此外，培養(yǎng)基成分對(duì)細(xì)菌素的產(chǎn)量也有很大的影響，是菌體生長和細(xì)菌素合成的重要因素[14-15]。研究表明，培養(yǎng)條件的優(yōu)化對(duì)于細(xì)菌素產(chǎn)量的提高有非常重要的影響[16-17]。

本試驗(yàn)以嗜酸乳桿菌為試驗(yàn)菌株，研究碳源、氮源種類、起始pH、培養(yǎng)溫度等因素對(duì)嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的影響。通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的培養(yǎng)條件，以期了解菌株特性和提高產(chǎn)細(xì)菌素水平。

1試驗(yàn)

1.1菌株

產(chǎn)細(xì)菌素菌株：嗜酸乳桿菌；指示菌株：大腸桿菌，均為實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2方法

1.2.1指示菌菌懸液的制備

將3環(huán)指示菌接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基，30 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)24 h，放置4 ℃冰箱備用。

1.2.2乳酸菌的培養(yǎng)及細(xì)菌素粗品的制備

1.2.2.1嗜酸乳桿菌種子液的制備

挑取3環(huán)已活化的嗜酸乳桿菌接種于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，作為種子液備用。

1.2.2.2嗜酸乳桿菌發(fā)酵上清液的制備

將種子液以2%接種量接種于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后，于4 ℃下8 000 r/min離心15 min，棄去沉淀，取上清液并經(jīng)0.45 μm孔濾膜過濾，于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3嗜酸乳桿菌細(xì)菌素粗品的制備

采用硫酸銨沉淀法，將發(fā)酵上清液用80%硫酸銨沉淀，磁力攪拌6 h后，在4 ℃下靜置12 h，10 000 r/min離心20 min，取沉淀溶解于去離子水中，4 ℃下6 000 r/min離心5 min，去除不溶物，保存?zhèn)溆肹18]。

1.2.2.4樣品的預(yù)處理與濃縮

取硫酸銨沉淀樣品加入截留分子質(zhì)量為1 ku 的透析袋中，4 ℃條件用去離子水透析12 h以上，期間換緩沖液4次以上，用以除去小分子雜質(zhì)和鹽離子，將嗜酸乳桿菌細(xì)菌素透析液，分裝至培養(yǎng)皿中(每個(gè)培養(yǎng)皿5 mL)，冷凍干燥至粉末，即為嗜酸乳桿菌細(xì)菌素粗樣品，保存?zhèn)溆肹19]。

1.2.3細(xì)菌素的活性評(píng)價(jià)

采用瓊脂擴(kuò)散法測定嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的抑菌能力[20]。取0.5 mL的指示菌菌懸液加入4.5 mL 無菌水中混勻。將指示菌稀釋10，100，1 000，10 000倍，用移液槍吸取100 μL的指示菌稀釋液到于平板上，用三角涂布棒涂勻。每個(gè)平板放1～3個(gè)牛津杯，然后用移液槍在牛津杯內(nèi)加入80 μL透析液。37 ℃培養(yǎng)24 h，用直尺測量抑菌圈直徑(包括牛津杯直徑)。

1.2.4培養(yǎng)基成分的確定

1.2.4.1碳源

分別以2%的蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉4種不同的糖類為碳源進(jìn)行發(fā)酵，確定最佳碳源。再添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最佳碳源，確定最適宜嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的碳源添加量。

1.2.4.2氮源

確定最佳碳源及其添加量后，選擇酵母膏作輔助氮源，分別以20%蛋白胨、20%牛肉膏、10%蛋白胨+10%牛肉膏、15%蛋白胨+5%牛肉膏、5%蛋白胨+15%牛肉膏作為氮源，確定最適宜嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的氮源。

1.2.4.3Tween-80用量

確定最佳氮源添加量后，選擇0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%的Tween-80，以確定最適宜嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的Tween-80添加量。

1.2.5培養(yǎng)基成分的正交優(yōu)化

將單因素篩選出的最佳碳源、氮源、Tween-80用量按L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)，共設(shè)9個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)基成分的正交因素及水平如表1所示。

表1　培養(yǎng)基成分的正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.6發(fā)酵條件單因素優(yōu)化試驗(yàn)

1.2.6.1初始pH

分別配制pH為5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5的培養(yǎng)液，確定嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的最適初始pH。

1.2.6.2培養(yǎng)溫度

確定初始pH后，選擇31，34，37，40，43 ℃試驗(yàn)，確定嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的最適培養(yǎng)溫度。

1.2.6.3接種量

在確定初始pH與溫度后，選擇接種量為1%，2%，3%，4%，5%進(jìn)行試驗(yàn)，確定嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的最佳接種量。

1.2.6.4培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化

在確定初始pH、溫度與接種量后，選擇培養(yǎng)時(shí)間為16，20，24，28，32 h進(jìn)行試驗(yàn)，確定嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的最適培養(yǎng)時(shí)間。

1.2.7發(fā)酵條件的正交優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇初始pH、培養(yǎng)溫度、接種量和培養(yǎng)時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，共設(shè)9個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。各因素水平如表2所示。以上試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行，測定指標(biāo)為抑菌圈直徑。

表2　發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)因素水平表

2結(jié)果與討論

2.1培養(yǎng)基成分的確定

2.1.1碳源

選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉，研究不同碳源對(duì)嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的影響，結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，以葡萄糖作為碳源抑菌圈直徑最大，達(dá)18.6 mm。因此選擇葡萄糖作為嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵碳源。

圖1　不同碳源對(duì)抑菌活性的影響

確定葡萄糖作為碳源后，考察不同添加量對(duì)嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，當(dāng)葡萄糖添加量為1.5%時(shí)，嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌圈直徑最大，達(dá)18.7 mm。

圖2　葡萄糖添加量對(duì)抑菌活性的影響

2.1.2氮源

選擇蛋白胨20%(A)、牛肉膏20%(B)、蛋白胨10%+牛肉膏10%(C)、蛋白胨15%+牛肉膏5%(D)、蛋白胨5%+牛肉膏15%(E)作為氮源,酵母膏為輔助氮源，考察不同氮源對(duì)抑菌活性的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，選擇10%蛋白胨+10%牛肉膏作為氮源嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌圈直徑最大，達(dá)19.1 mm。

圖3　不同氮源對(duì)抑菌活性的影響

2.1.3Tween-80用量

選擇不同的Tween-80添加量，考察Tween-80用量對(duì)抑菌活性的影響，結(jié)果如圖4所示。如圖4所示，Tween-80添加量為0.3%時(shí)，嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的抑菌圈直徑最大，達(dá)17.9 mm。

2.2培養(yǎng)基成分正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，各種因素對(duì)嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的影響由高到低依次為：牛肉膏(C)，葡萄糖(A)，蛋白胨(B)，Tween-80(D)。通過正交試驗(yàn)優(yōu)化，得到嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素最優(yōu)培養(yǎng)基為：葡萄糖1.5%、牛肉膏1.25%、蛋白胨1.0%、Tween-80 0.3%，此時(shí)抑菌圈直徑可達(dá)20.1 mm。

圖4　Tween-80用量對(duì)抑菌活性的影響

表3　培養(yǎng)基成分的正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3發(fā)酵條件單因素優(yōu)化結(jié)果

2.3.1初始pH

選擇優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，考察不同初始pH對(duì)抑菌活性的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，當(dāng)pH=6.5時(shí)，嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素直徑最大，可達(dá)18.9 mm。

圖5　初始pH對(duì)抑菌活性的影響

2.3.2培養(yǎng)溫度

考察不同培養(yǎng)溫度對(duì)抑菌活性的影響，結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，在37 ℃時(shí)，細(xì)菌素抑菌圈直徑最大，達(dá)到19.3 mm，而后隨著溫度的升高有所下降。其原因可能是溫度首先影響的各種酶的反應(yīng)速率以及蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，其次影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)。

圖6　溫度對(duì)抑菌活性的影響

2.3.3接種量

考察不同接種量對(duì)抑菌活性的影響，結(jié)果如圖7所示。當(dāng)接種量為3%時(shí)，細(xì)菌素抑菌圈直徑最大，達(dá)到20.2 mm。這是由于較小接種量可能使培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)不能被充分利用；而接種量過大可能會(huì)帶入過多的代謝廢物而不利于菌體生長并產(chǎn)生細(xì)菌素。

圖7　接種量對(duì)抑菌活性的影響

2.3.4培養(yǎng)時(shí)間

考察不同培養(yǎng)時(shí)間抑菌活性的影響，結(jié)果如圖8所示。確定24 h為最適宜嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的培養(yǎng)時(shí)間，此時(shí)細(xì)菌素抑菌圈直徑增最大，達(dá)到19.6 mm。這可能是由于16～24 h菌量未達(dá)到一定數(shù)目以至于細(xì)菌素產(chǎn)量較低，而24 h后，不斷有菌體死亡，且細(xì)菌素不斷吸附于菌體導(dǎo)致細(xì)菌素抑菌圈直徑下降。

圖8　培養(yǎng)時(shí)間抑菌活性的影響

2.4發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果

從表4可知，各種因素對(duì)嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素的影響由高到低依次為溫度，pH，接種量，時(shí)間。通過正交試驗(yàn)，得到嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)菌素最優(yōu)培養(yǎng)條件為pH 6.3，培養(yǎng)溫度37 ℃，接種量3%，培養(yǎng)時(shí)間22 h，此時(shí)抑菌圈直徑可達(dá)22.4 mm。

表4　發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

3結(jié)論

產(chǎn)細(xì)菌素最佳培養(yǎng)基組分為：蛋白胨10 g/L，牛肉膏12.5 g/L，葡萄糖15 g/L，檸檬酸氫三銨2 g/L，無水乙酸鈉5 g/L，碳酸鈣1 g/L，K2HPO4·3H2O 2.62 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，MnSO4·H2O 0.25 g/L，Tween-80 3 mL/L。最佳發(fā)酵條件為：初始pH 6.3、37 ℃、接種量3%、培養(yǎng)22 h。此條件下，其抑菌圈直徑可達(dá)22.4 mm，為優(yōu)化前的1.2倍。

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Optimization of culture conditions for bacteriocin production byLactobacillusacidophilus

HAOJianyun,TAOYe,LIUShiwen,XIAOShan,WANGHan,WANGJihui

( School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Abstract:The medium was optimized by single factor and orthogonal test to increase the yield of Lactobacillus bacteriocin. The antibacterial activity of the supernatant against Escherichia coli. was tested with agar diffusion, and the optimal composition of culture medium was determined according to the inhibition zone, The optimal composition was peptone 10 g/L, beef extract 12.5 g/L, yeast extract 5 g/L, glucose 15 g/L, C6H17N3O72 g/L, sodium acetate 5 g/L, CaCO31 g/L, K2HPO4·3H2O 2.62 g/L, MgSO4·7H2O 0.58 g/L, MnSO4·H2O 0.25 g/L, Tween-80 3 mL/L. The optimal fermentation conditions were pH 6.3, 37 ℃, inoculation 3%, culturing time 22 h. Under the conditions, the inhibition zone diameters could reach to 22.4 mm.

Key words:bacillus acidophilus; bacteriocin; culture conditions; antibacterial activity

作者簡介:郝建云(1990-)，女，碩士研究生；通信作者：王際輝(1970-)，男，教授.

基金項(xiàng)目:國家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201405003)；遼寧省農(nóng)業(yè)青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(2015004)；遼寧省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(LT2014010)；大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目(20140072).

收稿日期:2014-12-22.

中圖分類號(hào):TS201.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1674-1404(2016)01-0006-05