譚 為 黃旭暉 付婷婷 丘偉中 閔存云 王昌俊

五子衍宗丸中脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜分析

譚 為 黃旭暉 付婷婷 丘偉中 閔存云 王昌俊

目的明確五子衍宗丸中脂肪酸的組成和含量。方法采用索氏提取法對(duì)五子衍宗丸中的脂肪油進(jìn)行提取，甲酯化后，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)其脂肪酸的組成和含量進(jìn)行分析測(cè)定。結(jié)果五子衍宗丸中共測(cè)出19種脂肪酸，其中飽和脂肪酸9種，不飽和脂肪酸10種。其絕對(duì)含量分別為十四烷酸的含量為0.050%，十五烷酸甲酯的含量為0.004%，十六烷酸的含量為0.379%，十六烯酸的含量為0.005%，十七烷酸的含量為0.034%，十七碳烯酸甲酯的含量為0.002%，十八烷酸的含量為0.066%，十八烯酸的含量為0.447%，十八碳二烯酸的含量為1.080%，γ-十八碳三烯酸的含量為0.920%，α-十八碳三烯酸的含量為0.213%，二十烷酸的含量為0.005%，二十碳烯酸的含量為0.002%，HOMO-γ-二十碳三烯酸的含量為0.001%，二十二烷酸的含量為0.008%，二十二碳烯酸的含量為0.001%，二十三烷酸的含量為0.001%，二十四烷酸的含量為0.006%，二十四碳烯酸的含量為0.001%。結(jié)論五子衍宗丸含有的多種脂肪酸成分可能是其部分藥理作用的基礎(chǔ)。

五子衍宗丸;脂肪酸;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

【Author's address】 Guangdong General Hospital＆Guangdong Academy of Medical Sciences，Guangdong Geriatric Institute，Guangzhou，510080，China

五子衍宗丸由菟絲子、枸杞子、覆盆子、五味子及車(chē)前子組方，是著名的補(bǔ)腎良方。方中菟絲子性溫，入腎經(jīng)，以壯腎陽(yáng);枸杞子性甘平，入腎經(jīng)，補(bǔ)陰益精;覆盆子性微溫，歸腎經(jīng)，溫腎固精;五味子性溫，味酸甘，酸甘化陰，能補(bǔ)肝腎之陰;車(chē)前子利濕固氣，具有很好的補(bǔ)腎填精作用。全方陰陽(yáng)雙補(bǔ)，陰中求陽(yáng)，且邪有出路，兼顧填補(bǔ)腎氣，為方中之上品。據(jù)考證該方起源于唐代道教的《懸解錄》中，書(shū)中有張果獻(xiàn)給唐玄宗的五子守仙丸方，即是五子衍宗方的原貌［1］。1977年版藥典收載并更名為五子補(bǔ)腎丸，1985年至2010年版藥典收載為五子衍宗丸，具有補(bǔ)腎益精、種嗣衍宗之功，主要用于腎虛精虧所致的陽(yáng)痿不育、遺精早泄、腰痛、尿后余瀝。被譽(yù)為古今“種子第一方”，還被譽(yù)為“補(bǔ)陽(yáng)方藥之祖”，有“五子壯陽(yáng)、六味滋陰”之說(shuō)(五子即五子衍宗丸，六味即六味地黃丸)?，F(xiàn)代藥理研究表明［2-3］，五子衍宗丸作用廣泛。其在生殖系統(tǒng)方面能夠提高睪丸細(xì)胞存活率，同時(shí)可增強(qiáng)精子活力，達(dá)到促進(jìn)生殖功能作用［4］。在神經(jīng)系統(tǒng)方面能降低神經(jīng)功能損害來(lái)防治阿爾茲海默癥。此外，因其能調(diào)節(jié)免疫、抑制氧化反應(yīng)等作用，在抗腫瘤領(lǐng)域也有一定的成效［5］。研究表明，眾多單味中藥及中藥復(fù)方有抗疲勞作用［6-7］。我們前期研究表明［8-9］，五子衍宗丸對(duì)乳腺癌小鼠的化療相關(guān)性疲勞有明顯的緩解作用，發(fā)現(xiàn)給予五子衍宗丸干預(yù)的乳腺癌小鼠血漿中的神經(jīng)酸水平明顯提高。因此，我們推測(cè)神經(jīng)酸可能是緩解乳腺癌小鼠化療相關(guān)性疲勞的主要物質(zhì)之一。為進(jìn)一步明確五子衍宗丸中是否含有神經(jīng)酸我們進(jìn)行了本研究，現(xiàn)報(bào)告如下:

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菟絲子(批號(hào):141204701)、枸杞子(批號(hào):150307901)、覆盆子(批號(hào):150302691)、五味子(批號(hào):150306591)及車(chē)前子(批號(hào):150304711)，均購(gòu)自康美藥業(yè)股份有限公司。雙蒸水、甲醇、乙醇、鹽酸、乙醚、氫氧化鈉、三氟化硼、異辛烷、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Trace1300/ISQ型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(賽默飛世爾科);RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(亞榮生化儀器廠);BS110S型電子天平(賽多利斯天平公司)。

1.3 方法

1.3.1 脂肪油的提取

五子衍宗丸(按藥典中處方比例，枸杞子∶菟絲子∶覆盆子∶五味子∶車(chē)前子=8∶8∶4∶1∶2)采用索氏提取法提取油脂，方法參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T14772-2008《食品中粗脂肪的測(cè)定》。

1.3.2 脂肪油的甲酯化

將提取的油脂加入8mL2%的氫氧化鈉-甲醇溶液，80℃回流至油珠完全消失，冷卻后加入7mL15%三氟化硼-甲醇溶液，80℃回流5min后迅速冷卻，加異辛烷10mL，振搖5min，加入飽和氯化鈉溶液使有機(jī)層至瓶口，移取5mL有機(jī)層至離心管中，加入3 g無(wú)水硫酸鈉，輕輕振搖，過(guò)0.25μm有機(jī)濾膜，供GC-MS分析用。

1.3.3 脂肪酸的分析鑒定

色譜條件:色譜柱為 DB-WAX(30 m×0.25mm ×0.25μm);進(jìn)樣口溫度250℃;程序升溫:初始溫度70℃，以5℃/min升至250℃，保持5min檢測(cè)結(jié)束。載氣為氦氣，進(jìn)樣量為0.2μL，氣化溫度280℃;載氣流量1mL/min，分流比為100∶1。

質(zhì)譜條件:離子源為電子轟擊源;離子源溫度為230℃;電離電壓為70 eV;電子倍增器電壓為1988 V;發(fā)射電流為34.6μA;接口溫度為230℃;掃描范圍為50～550 m/z。

定性分析:取經(jīng)2.3.2項(xiàng)處理過(guò)的樣品0.4μL，用GC-MS進(jìn)行分析鑒定。通過(guò)Thermo Xcalibur3.0.63化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，檢索NIST MS Seach2.2質(zhì)譜圖庫(kù)，確定樣品中各個(gè)化學(xué)成分。

定量分析:通過(guò)Thermo Xcalibur3.0.63化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，分別求得各化學(xué)成分的絕對(duì)含量。

2 結(jié)果

經(jīng)GC-MS分析，五子衍宗丸脂肪酸甲酯總離子流譜圖如圖1所示。GC-MS分析結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，五子衍宗丸中共測(cè)出19種脂肪酸，其中十四烷酸、十五烷酸甲酯、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、二十烷酸、二十二烷酸、二十三烷酸、二十四烷酸等9種脂肪酸為飽和脂肪酸;十六烯酸、十七碳烯酸甲酯、十八烯酸、十八碳二烯酸、γ-十八碳三烯酸、α-十八碳三烯酸、二十碳烯酸、HOMO-γ-二十碳三烯酸、二十二碳烯酸、二十四碳烯酸等10種脂肪酸為不飽和脂肪酸。各種脂肪酸的絕對(duì)含量分別為十四烷酸(肉豆蔻酸)的含量為0.050%，十五烷酸甲酯的含量為0.004%，十六烷酸(軟脂酸)的含量為0.379%，十六烯酸的含量為0.005%，十七烷酸的含量為0.034%，十七碳烯酸甲酯的含量為0.002%，十八烷酸的含量為0.066%，十八烯酸的含量為0.447%，十八碳二烯酸的含量為1.080%，γ-十八碳三烯酸(亞油酸)的含量為0.920%，α-十八碳三烯酸(亞油酸)的含量為0.213%，二十烷酸的含量為0.005%，二十碳烯酸的含量為0.002%，HOMO-γ-二十碳三烯酸(亞麻酸)的含量為0.001%，二十二烷酸的含量為0.008%，二十二碳烯酸的含量為0.001%，二十三烷酸的含量為0.001%，二十四烷酸的含量為0.006%，二十四碳烯酸的含量為0.001%。

3 討論

本研究運(yùn)用GC-MS方法，分析了五子衍宗丸中的脂肪酸的含量及成分，結(jié)果表明，五子衍宗丸中含有9種飽和脂肪酸、10種不飽和脂肪酸。脂肪是機(jī)體結(jié)構(gòu)的一部分。植物油脂是飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的重要來(lái)源。目前對(duì)不飽和脂肪酸的研究較多，主要有降血糖、調(diào)節(jié)血脂、降膽固醇和抗血栓形成、防治心血管病、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育等［10］。飽和脂肪酸一向被認(rèn)為是“壞”脂肪酸，但有研究證明并非如此［11］。飽和脂肪酸能通過(guò)調(diào)節(jié)脂代謝，減少氧化應(yīng)激，減少炎癥及纖維化等多方面對(duì)酒精性肝病進(jìn)行防治［12］。此外，飽和脂肪酸還能提高精液質(zhì)量，進(jìn)食2周飽和脂肪酸的公豬的精子細(xì)胞外膜的組成發(fā)生獨(dú)特變化，有利于保持其精子活性［13］。這些不飽和脂肪酸及飽和脂肪酸可能是五子衍宗丸發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。我們前期研究發(fā)現(xiàn)［8］，給予五子衍宗丸干預(yù)的乳腺癌小鼠血漿中的神經(jīng)酸水平明顯提高。神經(jīng)酸屬于二十四碳烯酸類(lèi)的脂肪酸，又名鯊魚(yú)酸，學(xué)名順-15-二十四碳烯酸，是一種ω-9型低不飽和度、長(zhǎng)碳鏈脂肪烯酸，為人體非必需脂肪酸。神經(jīng)酸是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，能完整通透過(guò)血腦屏障，也是神經(jīng)細(xì)胞膜的重要組成部分，對(duì)離子通道和受體起著重要的調(diào)節(jié)作用，有恢復(fù)神經(jīng)末梢

圖1 五子衍宗丸脂肪酸甲酯總離子流色譜圖

表1 五子衍宗丸脂肪油中脂肪酸的組成及相對(duì)含量

活性，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育的功能［14］。以往神經(jīng)酸都是從深海鯊魚(yú)油或鯊魚(yú)腦中提取?，F(xiàn)代研究表明很多植物含有神經(jīng)酸，但神經(jīng)酸的含量相對(duì)較低。大多在含油脂量高的植物中(尤其是含油脂的果實(shí))，其中包括很多中藥［15］。五子衍宗丸復(fù)方中的五味中藥為植物的種子或果實(shí)，里面含有比較豐富的脂肪酸。本研究的結(jié)果表明五子衍宗丸復(fù)方中含有神經(jīng)酸。結(jié)合前期研究結(jié)果，我們可以推測(cè)，通過(guò)額外補(bǔ)充體內(nèi)神經(jīng)酸的水平而發(fā)揮緩解乳腺癌小鼠化療相關(guān)性疲勞的作用可能是其作用機(jī)制之一。五子衍宗丸廣泛的藥理作用可能與其獨(dú)特的脂肪酸組成有關(guān)。

［1］孔令青，李鳴鏑.中醫(yī)方劑“五子衍宗丸”組方的歷史源流［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2009，15(1):67-68.

［2］曾慶琪，孫 磊，聶 超，等.五子衍宗丸的藥理學(xué)研究進(jìn)展［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014，32(8):1935-1937.

［3］段 樺，朱春燕，袁偉暢，等.五子衍宗丸的藥理作用及臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2015，42(9):1814-1816.

［4］殷金龍，徐 淵，吳 斌.五子衍宗復(fù)方對(duì)睪丸支持細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡的影響［J］.中華男科學(xué)雜志，2013，19(3):257-261.

［5］王洪武，李守超，王光勇，等.五子衍宗方對(duì)H22荷瘤小鼠環(huán)磷酰胺化療的減毒作用［J］.中成藥，2012，34(11):2211-2214.

［6］吳 曄，歐楚良，馮 峰，等.搏能膠囊提高運(yùn)動(dòng)能力和改善疲勞的機(jī)制研究［J］.現(xiàn)代醫(yī)院，2015，15(10):38-40.

［7］周玲玲，陳以國(guó).中醫(yī)藥抗疲勞實(shí)驗(yàn)研究特點(diǎn)概況［J］.實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2015，29(7):180-181.

［8］譚 為.五子衍宗丸對(duì)腫瘤相關(guān)性疲勞小鼠的影響及作用機(jī)制研究［D］.廣州:南方醫(yī)科大學(xué)，2012.

［9］歐陽(yáng)明子，譚 為，劉艷艷，等.五子衍宗丸對(duì)小鼠乳腺癌化療敏感性及化療相關(guān)性疲勞的干預(yù)作用［J］.2013，29(11):1744-1747.

［10］林 杰.不飽和脂肪酸的生理功能及其應(yīng)用進(jìn)展［J］.廣東化工，2013，40(6):92-93.

［11］張 飛，柏云愛(ài)，魯海龍.飽和脂肪酸與健康研究進(jìn)展［J］.中國(guó)油脂，2012，37(4):29-33.

［12］王春暉，卿篤信.飽和脂肪酸對(duì)酒精性肝病的作用及機(jī)制［J］.國(guó)際消化病雜志，2010，30(6):346-348.

［13］李戰(zhàn)勝.飽和脂肪酸有利豬精液質(zhì)量［J］.江西畜牧獸醫(yī)雜志，1996，6(3):62.

［14］王性炎，王姝清.神經(jīng)酸研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景［J］.中國(guó)油脂，2010，(3):1-5.

［15］馬柏林，梁淑芳，趙德義，等.含神經(jīng)酸植物的研究［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2004(12):2362-2365.

Gas Chromatography-Mass Spectrometry Analysis of Fatty Acids in Compound Wuziyanzong Pill

TAN Wei，HUANG Xuhui，F(xiàn)U Tingting，et al

ObjectiveThe fatty acids were extracted from compound Wuziyanzong Pill and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry(GC/MS).MethodsThe fatty acids of compound Wuziyanzong Pill were extracted by Soxhlet extraction，and their fatty acid compositions and content were analyzed by GC-MS.ResultsThe results of GC-MS analysis showed that19 acids are found in compound Wuziyanzong Pill and10 of them were unsaturated fatty acids，and the rest were saturated fatty acids.The absolute content of tetradecanoic acid was0.050%，pentadecanoate acid was0.004%，hexadecanoic acid was0.379%，hexadecenoic acid was0.005%，margatic acid was0.034%，heptadecenoic was0.002%，octadecanoic acid was0.066%，oleic acid was0.447%，octadecadienoic acid was1.080%，6，9，12-octadecatrienic acid was0.920%，9，12，15-octadecatrienic acid was0.213%，eicosanoic acid was0.005%，eicosenoic acid was0.002%，8，11，14-eicosatrienoic acid was0.001%，docosanoic acid was0.008%，docosenoic acid was0.001%，tricosanoic acid was0.001%lignoceric acid was0.006%，nervonic acid was0.001%，respectively.ConclusionThe compound Wuziyanzong Pill contains kinds of fatty acids.These fatty acids maybe partial material bases of pharmacology of compound Wu-Zi-Yan-Zong.

Wuziyanzong Pill;Fatty Acid;Gas Chromatography-Mass Spectrometry

R284.2

:Adoi:10.3969/j.issn.1671-332X.2016.08.033

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):81302958，81373582);廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省課題資助(編號(hào):20131102，20151019，20151018)

譚 為 黃旭暉 付婷婷 丘偉中 閔存云 王昌俊:廣東省人民醫(yī)院//廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院//廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所 廣東廣州510080

王昌俊