勞穗華 謝 貝 董海平 張言斌 孟繁榮 俞朝賢 陳 華 鄧曉華 王 楠楊 瑜 雷 杰 牛 群 劉志輝

肺結(jié)核治療過程中血清IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-17A、IL-4、IL-6和IP10水平動態(tài)觀察

勞穗華 謝 貝 董海平 張言斌 孟繁榮 俞朝賢 陳 華 鄧曉華 王 楠楊 瑜 雷 杰 牛 群 劉志輝

目的分析肺結(jié)核患者治療過程中血清IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-17A、IL-4、IL-6和IP10水平的動態(tài)變化，以進(jìn)一步闡明這些因子與結(jié)核病發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)性。方法應(yīng)用液相芯片技術(shù)檢測59例成功治愈的初治菌陽肺結(jié)核患者治療前、治療2個月末和6個月末的血清IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-17A、IL-4、IL-6和IP10水平，應(yīng)用配對t檢驗分別比較各因子3個時點間的血清表達(dá)水平差異。結(jié)果3個時間點血清IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-17A、IL-4、IL-6和IP10水平(pg/mL):治療前分別為1.71±0.91、5.02±11.53、2.48±11.03、1.12±0.46、0.36±1.87、8.99±7.82和882.74±1110.73，治療2個月末分別為2.39±1.47、8.95±13.76、1.77±1.80、0.96±0.22、0.51±1.11、4.75±4.16和408.38±492.27，治療6個月末分別為1.84±0.93、5.14±10.16、1.59±0.78、0.79±0.22、0.44±0.48、4.05±4.51和177.57±104.83。治療前與治療2個月末及治療6個月末的IL-6水平、治療前與治療2月末的IL-10和IL-12p40水平以及治療前、治療2個月末、6個月末的IL-17A和IP10水平均有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)論血清IL-17A、IP10、IL-6、IL-10和IL-12p40水平與結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)。

結(jié)核/肺;細(xì)胞因子;液相芯片

【Author's address】 Guangzhou Chest Hospital，Guangzhou，510095，China

對于結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展，目前人們已經(jīng)了解到人體感染結(jié)核分枝桿菌后是否進(jìn)展為結(jié)核病，取決于病原菌與宿主防御間的力量對決，其中以細(xì)胞免疫為主體的宿主防御能力的大小決定結(jié)核病發(fā)生發(fā)展方向［1］。其中，各種細(xì)胞因子作為各種免疫細(xì)胞的激活與強(qiáng)化其功能的重要介質(zhì)而在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［2］。但細(xì)胞因子的功能呈現(xiàn)多效性、重疊性、協(xié)同性、拮抗性、網(wǎng)絡(luò)性等特點［3］，各種細(xì)胞因子在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展中的作用遠(yuǎn)未明晰。為此，我們對目前認(rèn)為與結(jié)核密切相關(guān)的IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-17A、IL-4、IL-6和IP10等細(xì)胞因子［4］在結(jié)核病治療過程中的動態(tài)水平進(jìn)行了觀察，現(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

在我院結(jié)核病生物樣本庫中選取2013年1月-2013年12月在抗結(jié)核治療前、治療2個月末和治療6個月末有血樣采集的59例成功治愈的初治菌陽(抗酸桿菌涂片或分枝桿菌培養(yǎng)陽性并鑒定為結(jié)核分枝桿菌者)肺結(jié)核病患者，其中:男34例，年齡17～75歲，平均42.0歲。女25例，年齡17～78歲，平均41.0歲。

1.2 儀器和試劑

應(yīng)用多功能液相芯片系統(tǒng)luminex200(luminex公司)、采用MILLIPLEX MAP試劑盒(EMD Millipore公司)進(jìn)行IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-17A、IL-4、IL-6和IP10等細(xì)胞因子檢測。

1.3 血清樣本采集

在患者抗結(jié)核治療前、治療2個月末和治療6個月末采集患者靜脈血，常規(guī)分離血清，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)胞因子檢測

從結(jié)核病生物樣本庫中取出待檢樣本，室溫凍融;嚴(yán)格按照儀器和試劑說明書操作，檢測目的細(xì)胞因子。主要實驗步驟包括:①每孔加入200μL洗脫液，室溫震搖10min，棄掉洗脫液;②各孔分別加25μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣本(空白孔加入生理鹽水)、25μL試驗液、25μL基質(zhì)液和25μL磁珠;③以上混合液室溫震搖孵育2 h;④ 使用磁力平板洗滌器洗滌平板2次后，每孔加入25μL1×檢測抗體，室溫震搖孵育1 h;⑤每孔加入25μL鏈霉親和素-藻紅蛋白，室溫震搖孵育30min;⑥加200μL洗脫液洗板2次，每孔加入150μL鞘液重懸磁珠，室溫震搖5min;⑦Luminex200TM系統(tǒng)檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS18統(tǒng)計分析患者抗結(jié)核治療前、治療2個月末和治療6個月末 IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-17A、IL-4、IL-6和IP10等細(xì)胞因子的血清水平±s/(pg·mL-1)，并行配對t檢驗分別比較各因子三個時點間的血清表達(dá)水平差異。

2 結(jié)果

血清IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-17A、IL-4、IL-6和IP10水平見表1。

經(jīng)正態(tài)性檢驗，這些細(xì)胞因子水平均服從正態(tài)分布，經(jīng)方差齊性檢驗所分析的配對樣本總體方差齊性。行配對t檢驗，治療前與治療2個月末及治療6個月末的IL-6水平、治療前與治療2個月末的IL-10和IL-12p40水平以及治療前、治療2個月末、6個月末的IL-17A和IP10水平有顯著性差異(P＜0.05)。

表1 59例成功治愈菌陽肺結(jié)核患者治療前、2月末和6月末各細(xì)胞因子水平及其比較 (±s，pg/mL)

表1 59例成功治愈菌陽肺結(jié)核患者治療前、2月末和6月末各細(xì)胞因子水平及其比較 (±s，pg/mL)

注:1)前/中、中/后和前/后分別指治療前與治療2個月末、治療2個月末與治療6個月末、治療前與治療6個月末比較

細(xì)胞因子 IL-10 IL-12 p40 IL-12 p70 IL-17A IL-4 IL-6 IP-10細(xì)胞因子水平 治療前 1.71±0.91 5.02±11.53 2.48±11.03 1.12±0.46 0.36±1.87 8.99±7.82882.74±1110.732月末 2.39±1.47 8.95±13.76 1.77±1.80 0.96±0.22 0.51±1.11 4.75±4.16 408.38±492.276月末 1.84±0.93 5.14±10.16 1.59±0.78 0.79±0.22 0.44±0.48 4.05±4.51 177.57±104.83配對t檢驗1)t前/中P前/中-3.5490.001-2.1070.0390.5260.6012.6660.010-0.5310.5974.3020.0003.2720.002 t中/后P中/后2.9950.0042.8640.0060.8740.3865.8550.0000.4550.6510.9420.3503.9890.000 t前/后4.9320.000 P前/后-0.8720.387-0.0900.9290.6280.5325.5290.000-0.3600.7204.6080.000

3 討論

血清IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-17A、IL-4、IL-6和IP10等細(xì)胞因子主要由淋巴細(xì)胞或單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，其功能作用主要為:IL-10抑制活化的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生IL-12而負(fù)調(diào)節(jié)IFN-γ的分泌，IL-12刺激NK細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ并促進(jìn)Th0細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，IL-17是參與固有免疫和加強(qiáng)適應(yīng)性免疫的重要因子，IL-4促進(jìn)Th2細(xì)胞分化，IL-6促進(jìn)B淋巴細(xì)胞功能并參與誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，IP-10則為一種IFN-γ誘導(dǎo)蛋白而促進(jìn)其分泌［5］。來自南非的一項研究［6］顯示包括上述細(xì)胞因子在內(nèi)的30個細(xì)胞因子在抗結(jié)核治療過程中的動態(tài)變化可以指示機(jī)體對抗結(jié)核治療反應(yīng)性快慢。我們的分析結(jié)果也表明治療前與治療2個月末及治療6個月末的IL-6水平、治療前與治療2個月末的IL-10和IL-12p40水平以及治療前、治療2個月末、6個月末的IL-17A和 IP10水平有顯著性差異(P＜0.05)。我們可以設(shè)想:結(jié)核病發(fā)生發(fā)展可以視為結(jié)核病治愈的逆過程，這些細(xì)胞因子參與了結(jié)核病發(fā)生發(fā)展過程。

從表1可以看到:血清IL-10水平治療前顯著低于治療2個月末，而治療6個月末又恢復(fù)到治療前水平;治療前血清IL-12 p40水平顯著低于治療2個月末、治療2個月末顯著高于6個月末;血清IP-10水平則隨有效治療的進(jìn)行而不斷降低。直觀來看似與上述這些細(xì)胞因子的主要功能作用有些相互矛盾:治療前IL-10水平的低下應(yīng)有較高水平的IL-12 p40，治療6個月末的低水平IL-10應(yīng)使6個月末的IP-10水平上調(diào)。但從細(xì)胞因子功能的多效性、重疊性、協(xié)同性、拮抗性、網(wǎng)絡(luò)性等特點［3］的角度理解，更加提醒人們細(xì)胞因子在抗結(jié)核免疫過程中的復(fù)雜性，有待深入研究。

從這些細(xì)胞因子在抗結(jié)核治療過程中的動態(tài)變化來看，在網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性的背后，我們應(yīng)注意到:治療過程中患者血清IL-17A和IP-10表達(dá)水平不斷下降的變化趨勢。IL-17A作為連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的效應(yīng)分子、IP-10作為IFN-γ誘導(dǎo)蛋白在抗結(jié)核過程中作用非同尋常。那么，我們是否可以認(rèn)為:這些細(xì)胞因子的復(fù)雜作用結(jié)果最后可以聚焦于IL-17A、IP-10水平的變化，因為IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-4、IL-6等的作用均與IFN-γ分泌密切相關(guān);正如IFN-γ水平可以指示結(jié)核分枝桿菌感染一樣，血清IL-17A、IP-10水平聯(lián)結(jié)著結(jié)核病活動性水平。IL-17AIP-10作為Th17細(xì)胞的主要分泌因子、IP-10作為IFN-γ誘導(dǎo)蛋白是否可以真正聯(lián)結(jié)結(jié)核病活動性水平呢?本文分析結(jié)果難以深刻闡明，假若在治療失敗結(jié)核病例中觀察不到IL-17A、IP-10的此種動態(tài)變化，這一聯(lián)結(jié)即應(yīng)成立。作為本研究的繼續(xù)，我們在后續(xù)的6例治療失敗結(jié)核病例研究中未能觀察到此種動態(tài)變化。但其內(nèi)在本質(zhì)如何，尚待大樣本量的研究而得出科學(xué)結(jié)論。與此同時，從表1還可看到在不同時點不同細(xì)胞因子水平的分析中有11個水平的標(biāo)準(zhǔn)差大于其平均值，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在這些分析項實驗數(shù)據(jù)中均有3～4個離群值數(shù)據(jù)，按Chanwennt準(zhǔn)則其出現(xiàn)概率超過1/2n(n為樣本量)不宜舍棄。說明這些因子在血清的表達(dá)水平離散程度較大，也從另一側(cè)面反映了細(xì)胞因子在抗結(jié)核免疫過程中的復(fù)雜性。據(jù)此，這些因子能否作為結(jié)結(jié)核病活動性水平的觀察指標(biāo)有待擴(kuò)大樣本量分析以進(jìn)一步證實。

另外，本文的分析數(shù)據(jù)還展現(xiàn)了一個可能的實際應(yīng)用前景，即通過結(jié)核病患者治療過程中血清IL-17A、IP-10水平的監(jiān)測指示抗結(jié)核治療效果。目前，對于抗結(jié)核治療療效最常用的評價指標(biāo)是治療2個月末與6個月末的痰菌陰轉(zhuǎn)率、影像學(xué)檢查結(jié)果改變及臨床癥狀的改善情況。其缺陷顯而易見，最直接的后果是:一旦化療療效不理想，即實際上我們對患者至少進(jìn)行了2個月的不合理化療，從而導(dǎo)致疾病慢性化、耐藥性產(chǎn)生的風(fēng)險大大增加。若能通過更短時間的血清IL-17A、IP-10水平監(jiān)測指示抗結(jié)核治療的效果，其臨床應(yīng)用價值不言而喻，值得關(guān)注，我們正在進(jìn)行這一工作。

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［3］曹雪濤.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2013:49-57.

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多囊腎潛在治療靶點:HDAC6

常染色體顯性多囊腎(ADPKD)是一種遺傳性疾病，發(fā)病率為1∶1000～1∶500，臨床特點為腎小管內(nèi)囊腫形成，囊內(nèi)充滿液體。囊腫進(jìn)展性增大，并取代腎實質(zhì)，近50%的ADPKD患者在50歲左右可進(jìn)展為終末期腎病。ADPKD是一種由PKD1或PKD2基因突變引起的異質(zhì)性疾病。PKD1或PKD2基因突變可導(dǎo)致多個與囊腫生長相關(guān)的信號通路失調(diào)。動物模型結(jié)果顯示，靶向作用于特殊通路可延緩囊腫生長，但目前為止ADPKD尚不可治愈。

摘自《醫(yī)學(xué)論壇網(wǎng)》

Dynamic Survey of IL-10，IL-12p40，IL-12p70，IL-17A，IL-4，IL-6 and IP10 in Serum during Treatment of Patients with Pulmonary Tuberculosis

LAO Suihua，XIE Bei，DONG Haiping，et al

ObjectiveTo further understand the correlation between progression of tuberculosis with these cytokines by dynamic analysis of levels of IL-10，IL-12p40，IL-12p70，IL-17A，IL-4，IL-6 and IP10 in serum during treatment of patients with pulmonary tuberculosis.MethodsIL-10，IL-12p40，IL-12p70，IL-17A，IL-4，IL-6 and IP10 in serum of59 patients with pulmonary tuberculosis and treated successfully at three point of time，including before treatment and the end of second and sixth month during period of treatment，were detected with liquid chip technology.The general levels of these cytokines at per point of time were compared respectively by paired t-test.ResultsThe general levels(pg/ml)of IL-10，IL-12p40，IL-12p70，IL-17A，IL-4，IL-6 and IP10 in serum were2.39±1.47，8.95±13.76，1.77±1.80，0.96±0.22，0.51±1.11，4.75±4.16，408.38±492.27 at the end of second month and1.84±0.93，5.14±10.16，1.59±0.78，0.79±0.22，0.44±0.48，4.05±4.51，177.57±104.83 at the end of sixth month during period of treatment while they were1.71±0.91，5.02±11.53，2.48±11.03，1.12±0.46，0.36±1.87，8.99±7.82 and882.74±1110.73 before treatment respectively.There were significantly differences between the levels of IL-6 at the end of second month and that before treatment and between that at sixth month and that before treatment.There were also significantly differences between the levels of IL-10 and IL-12p40 at the end of second month and that before treatment.As to IL-17A and IP10，there were significantly differences between each other of their levels at three point of time.ConclusionIt seems probable that there are strong correlations between progression of tuberculosis and levels of IL-17A，IP10，IL-6，IL-10 and IL-12p40 in serum.

Tuberculosis/Pulmonary;Cytokine;Liquid Chip Technology

R521;R446.6

:Adoi:10.3969/j.issn.1671-332X.2016.08.028

廣東省科技計劃項目(編號:粵科規(guī)財字［2015］110號32);廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金(編號:A2016383);廣州市科技計劃項目(編號:2014Y2-00117，155700012)

勞穗華 謝 貝 董海平 張言斌 孟繁榮 俞朝賢 陳 華

鄧曉華 王 楠 楊 瑜 雷 杰 牛 群 劉志輝:廣州市胸科醫(yī)院 廣東廣州 510095

劉志輝