孫玉慧，李天寶，范志超，李文斌

（1.江門出入境檢驗檢疫局，廣東江門529000；2.北京迪馬科技有限公司，北京100029）

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固相萃取-高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中甲氧芐啶殘留量

孫玉慧1，李天寶1，范志超1，李文斌2

（1.江門出入境檢驗檢疫局，廣東江門529000；2.北京迪馬科技有限公司，北京100029）

摘要：建立固相萃取-高效液相色譜法檢測水產(chǎn)品中甲氧芐啶殘留量的分析方法。試樣用15mL 5%乙酸水-甲醇（70∶30，ν∶ν）、1mL乙酸鉛（200g/L）、7mL三氯甲烷混合液提取，提取液經(jīng)ProElut PXC固相萃取柱凈化，高效液相色譜儀對水產(chǎn)品中甲氧芐啶殘留量進行測定。在0.02～0.20mg/L范圍內(nèi)甲氧芐啶的質(zhì)量濃度與色譜峰面積呈良好的線性關系，相關系數(shù)為0.9993，方法的檢出限（S/N=3）為0.02mg/L，平均回收率為83.4%～87.0%，相對標準偏差（RSD）為3.9%～4.9%。該方法適合水產(chǎn)品中甲氧芐啶殘留量的日常監(jiān)測。

關鍵詞：固相萃??；高效液相色譜；水產(chǎn)品；甲氧芐啶

0　引言

甲氧芐啶屬于廣譜抗菌藥，有抑制二氫葉酸還原酶的作用，但細菌較易產(chǎn)生耐藥性，很少單獨使用。甲氧芐啶通常作為可抑制二氫葉酸合成酶的磺胺類藥物增效劑，與磺胺類或其他抗生素配合使用，可以使細菌的葉酸代謝受到雙重阻斷，抗菌作用增強幾倍甚至幾十倍[1-7]。正是由于其獨特的作用，甲氧芐啶在養(yǎng)殖業(yè)病害防治中被廣泛應用[8-13]。

根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)部農(nóng)辦質(zhì)[2011]1號文件要求，自2011年4月1日起，必須對所有新申報無公害農(nóng)產(chǎn)品的淡水魚開展甲氧芐啶含量檢驗項目，限量要求為50μg/kg。

本文通過研究簡化了樣品前處理步驟、優(yōu)化了儀器分析條件，建立了固相萃取-高效液相色譜法檢測水產(chǎn)品中甲氧芐啶殘留量的分析方法。

1　材料與方法

1.1試驗材料

試驗用鱈魚，去鱗、去皮，沿脊背取肌肉；冷凍蝦仁，去頭、去殼、去腸腺，取肌肉部分。樣品充分絞碎、混勻，于-20℃冷凍保藏。試驗所用水產(chǎn)品均購自市場。

1.2主要儀器設備

高效液相色譜，配有DAD檢測器（AgiLent1100，美國安捷倫公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-210型，瑞士步琦有限公司）；離心機（3-30K型，德國Sigma實驗室離心機股份有限公司），超聲波清洗儀（DL-720B，上海之信儀器公司）；水浴恒溫振蕩器（金壇市開發(fā)區(qū)吉特實驗儀器廠）；固相萃取柱（ProElut PXC，150 mg/6 mL，北京迪馬科技有限公司）。

1.3試劑

甲氧芐啶標準品（Dr.Ehrenstorfer公司）；甲醇（分析純），三氯甲烷（分析純），丙酮（分析純），乙酸（分析純），乙酸鉛（分析純）；試驗用水應符合GB/T 6682——2008《分析實驗室用水國家標準》一級水的標準。

1.4樣品前處理方法

取適量新鮮或解凍的魚、蝦等水產(chǎn)品，用剪刀剪取適量肌肉，放入機器中攪碎并使之均質(zhì)，準確稱取5.0g樣品，依次加入5%乙酸水∶甲醇溶液（70∶30，ν∶ν）15mL、200g/L乙酸鉛1mL和三氯甲烷7mL，混勻，渦旋2min后超聲提取5min，在8000r/min下離心2min，收集上清液；將下層殘留物再依次加入5%乙酸水∶甲醇（70∶30，ν∶ν）15mL、200g/L乙酸鉛1mL按照上述步驟重復提取一次，合并兩次上清液，待凈化。

固相萃取柱依次加入甲醇5mL及5%乙酸水∶甲醇（70∶30，ν∶ν）溶液5mL進行活化，將待凈化提取液全部加入經(jīng)過活化的固相萃取柱，棄去流出液；再依次加入5 mL的5%乙酸水∶甲醇（70∶30，ν∶ν）溶液和5mL甲醇進行淋洗，棄去流出液；再加入5mL的5%氨水甲醇進行洗脫，收集洗脫液；將洗脫液在40℃下減壓蒸餾至近干，用流動相溶液重新溶解樣品并定容至1mL，備用，供HPLC分析。

1.5色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18（250mm×4.6mm×5μm）；進樣量為20μL；流量為1.0mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為230nm；流動相為0.1%甲酸水溶液∶甲醇（80∶20，ν∶ν）。

2　結(jié)果與討論

2.1試驗條件的優(yōu)化

主要對提取條件及固相萃取柱凈化條件進行了優(yōu)化。在提取操作中，采用5%乙酸水∶甲醇（70∶30，ν∶ν）、乙酸鉛（200g/L）和三氯甲烷的混合液對水產(chǎn)品中的甲氧芐啶進行了有效提取，不需調(diào)整pH值、二氯甲烷反萃等復雜步驟，提取步驟大大簡化；在固相萃取中，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，用5mL甲醇、5mL 5%乙酸水∶甲醇（70∶30，ν∶ν）活化固相萃取柱，用5 mL 5%氨水甲醇溶液的洗脫效果最好；高效液相色譜檢測條件的優(yōu)化是使樣品色譜峰取得較好的分離效果且干擾最小，并在此基礎上進一步優(yōu)化其他參數(shù)。對二極管陣列檢測器波長掃描選擇最大吸收波長，考察了Diamonsil C18（250mm×4.6mm×5μm）、Envirosep-CM （175mm×3.2mm×5μm）、ZORBAX Eclipse XDB-C18 （150mm×4.6mm×5μm）3種色譜柱對標樣的分離情況，并進行了流動相種類和流速等條件的選擇，實驗結(jié)果表明，色譜柱，Diamonsil C18（250mm×4.6mm× 5μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液∶甲醇=80∶20（ν∶ν）；流量1.0 mL/min；檢測波長230 nm；柱溫為30℃時，可滿足分析的要求。

2.2標準曲線和檢出限

對0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50 mg/L的標準溶液進行測定，繪制工作曲線（見圖1），相關系數(shù)r2=0.9993，可以看出其工作曲線在需要的線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系。以信噪比S/N=3時對應的甲氧芐啶含量確定的檢出限為0.02mg/L，檢出限較低，表明該方法的靈敏度較好。

圖1　甲氧芐啶標準曲線

表1　方法回收率及精密度

2.3方法的回收率和精密度

分別以鱈魚和蝦仁兩種水產(chǎn)品為基質(zhì)，在0.02，0.20mg/L兩個質(zhì)量濃度水平上做加標回收試驗，每個添加做5個平行，得到方法的回收率和精密度如表1所示?？梢钥闯?，兩種基質(zhì)在兩個濃度水平上回收率都比較好，說明該方法準確度較高；相對標準偏差RSD值均較小，表明該方法的重復性良好。

2.4樣品的測定

從市場購買了鱈魚和蝦仁各5個樣品，按本文所建立的方法進行測定，結(jié)果和色譜圖分別如表2和圖2所示。由表可知，目前市場上鱈魚和蝦仁中甲氧芐啶殘留量安全狀況良好，雖然有兩例陽性樣品，但結(jié)果均低于我國要求的0.05mg/L的限量值。由圖2可以看出，在實際樣品檢測過程中，雖然甲氧芐啶含量較低，但其色譜圖峰型良好，與周邊雜質(zhì)色譜峰能夠完全分開，表明該方法具有很好的可靠性。

3　結(jié)束語

本文采用5%乙酸水∶甲醇（70∶30，ν∶ν）、乙酸鉛（200g/L）、三氯甲烷混合液對水產(chǎn)品中的甲氧芐啶進行了有效提取，固相萃取柱凈化，并建立了一種高效液相色譜法對甲氧芐啶進行了定性定量分析。所建立的方法具有良好的精密度和準確度，并且與我國國家標準GB 29702——2013《食品安全國家標準水產(chǎn)品中甲氧芐啶殘留量的測定高效液相色譜法》相比，本方法提取步驟大大簡化，不需經(jīng)過調(diào)整pH值、二氯甲烷反萃等復雜步驟即可完成甲氧芐啶提??；實驗成本大大降低，固相萃取柱只用5mL氨水甲醇洗脫，遠低于國標方法中15mL洗脫液用量；雜質(zhì)干擾大大減少，加標回收率達80%以上，保證實驗結(jié)果的準確性、重現(xiàn)性。該方法可為水產(chǎn)品的日常檢測及監(jiān)管部門的監(jiān)督抽查提供科學依據(jù)，具有良好的應用前景。

表2　鱈魚和蝦仁樣品中甲氧芐啶的分析結(jié)果

圖2　鱈魚樣品中甲氧芐啶檢測液相色譜圖

參考文獻

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（編輯：徐柳）

Determination of trimethoprim in aquatic products by SPE-HPLC

SUN Yuhui1，LI Tianbao1，F(xiàn)AN Zhichao1，LI Wenbin2
（1. Jiangmen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Jiangmen 529000，China；2. Dikma Technologies Incorporation，Beijing 100029，China）

Abstract:A method for determining the trimethoprim content in aquatic products was developed based on solid -phase extraction（SPE）and high performance liquid chromatography（HPLC）. Samples were extracted with the mixture of 5% acetic acid-methanol（15mL，ν∶ν=70∶30），lead acetate（1mL，200 g/L）and trichlormethane（7 mL）and then purified with a solid-phase extraction column ProElut PXC. The extract liquid was determined by HPLC. The concentration of the trimethoprim was linear with the peak area in the range of 0.02-0.20 mg/L. The correlation coefficient was 0.999 3，the limit was 0.02 mg/L，the average recovery rate was 83.4%-87.0%，and the relative standard deviation（RSD）was 3.9%-4.9%. The method can be applied to determine the trimethoprim content in aquatic products.

Keywords:SPE；HPLC；aquatic products；trimethoprim

通訊作者：李天寶（1981-），男，高級工程師，碩士，主要從事進出口商品中有害物質(zhì)的檢驗及研究。

作者簡介：孫玉慧（1976-），女，遼寧莊河市人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事進出境人員疾病檢查工作。

基金項目：國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2015K063）

收稿日期：2015-05-26；收到修改稿日期：2015-08-06

doi：10.11857/j.issn.1674-5124.2016.02.012

文獻標志碼：A

文章編號：1674-5124（2016）02-0056-03