陳鳳蓮，鮑　歡，曲　敏，李凌俐（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱　150076）

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冰結(jié)構(gòu)蛋白抗凍活性檢測(cè)研究進(jìn)展

陳鳳蓮，鮑歡，*曲敏，李凌俐
（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150076）

摘要：通過介紹近年來海洋魚類、昆蟲類、植物類及細(xì)菌和真菌類冰結(jié)構(gòu)蛋白的抗凍活性檢測(cè)研究進(jìn)展，對(duì)利用冰晶和熱滯活性2種檢測(cè)方法進(jìn)行了較全面的闡述，并提出建立對(duì)冰結(jié)構(gòu)蛋白抗凍活性的冰晶觀察和差示掃描量熱法測(cè)熱滯活性的聯(lián)合檢測(cè)觀點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：冰結(jié)構(gòu)蛋白；冰晶；熱滯活性

0　引言

冰結(jié)構(gòu)蛋白（Ice structuring protein，ISP），又稱為抗凍蛋白、不凍蛋白（Antifreeze protein，AFP）、熱滯蛋白，具有控制冰晶生長(zhǎng)、修飾冰晶形態(tài)和抑制重結(jié)晶三大特征[1]。ISPs能修飾冰晶的形態(tài)，即通過與水分子的特異性結(jié)合，改變冰晶的形態(tài)；ISPs能非依數(shù)性降低水溶液的冰點(diǎn)，而不影響其熔點(diǎn)，從而產(chǎn)生水溶液冰點(diǎn)溫度和熔點(diǎn)溫度的差異，二者之間的差值被稱為熱滯活性（Thermal hysteresis activity，THA）[2-4]。利用THA系數(shù)可以表示其抗凍活性。熔點(diǎn)越高（低）冰點(diǎn)越低（高），即二者差異越明顯，表示ISPs的活性越強(qiáng)，所以通過THA可以評(píng)價(jià)一種ISPs的抗凍活性。目前，根據(jù)其特征，常用ISPs抗凍活性的檢測(cè)方法可以歸納為3種[5]：一是冰晶觀察檢測(cè)法，該方法使用顯微鏡對(duì)冰晶形態(tài)進(jìn)行觀察，操作簡(jiǎn)單，冰晶形態(tài)直觀性強(qiáng)，但由于是肉眼進(jìn)行觀察，誤差較大；二是微量滲透壓計(jì)法，該方法是根據(jù)體系結(jié)晶前后的滲透壓變化，通過經(jīng)驗(yàn)公式來計(jì)算THA，測(cè)定結(jié)果的精確度和重復(fù)性都較高，缺點(diǎn)在于無法精確控制和測(cè)定體系的冰晶含量，不利于進(jìn)一步揭示結(jié)晶過程中體系發(fā)生的變化；三是差示掃描量熱法（Differential scanning calorimetry，DSC），該方法由于能夠?qū)ΡШ繙?zhǔn)確控制，得到結(jié)果的精確度和重復(fù)性比較高，使其成為目前對(duì)ISPs的THA檢測(cè)最常用方法。目前，在評(píng)價(jià)ISPs的抗凍活性時(shí),多數(shù)研究通過采用DSC檢測(cè)其THA值來確定，沒有全面反應(yīng)出ISPs的特征。本文綜述了海洋魚類、昆蟲類、植物類、細(xì)菌與真菌類的ISPs抗凍活性檢測(cè)方法，旨在提出全面檢測(cè)與評(píng)價(jià)ISPs抗凍活性的方法。

1　海洋魚類ISPs的抗凍活性檢測(cè)

1969年斯坦福大學(xué)Devries在南極Mcmurdo海峽的一種Nototheneniid魚血液中首先發(fā)現(xiàn)了具有這種性質(zhì)的ISPs。接著，Jong Kyu Lee等人[6]提取了南極魚類中的蛋白，將其純化后與大腸桿菌提取液和磷酸鹽緩沖液進(jìn)行冰晶形態(tài)的對(duì)比觀察，發(fā)現(xiàn)了該蛋白提取液中有六角冰晶形態(tài)，而大腸桿菌和磷酸鹽緩沖溶液中只有圓形或不規(guī)則形狀的冰晶。蛋白提取液在低質(zhì)量濃度下，有雙棱錐形狀的冰晶；而在較高質(zhì)量濃度下，有針狀冰晶。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，THA值為0.7℃。Type III型ISPs由幾種生活在冰島上的海洋魚類中檢出，Christopher P等人[7]發(fā)現(xiàn)野生Type III型蛋白中具有六角形和雙棱錐形狀的冰晶，并且能夠顯著地阻止冰晶的生長(zhǎng)。賈弘禔、鞏子路等人[8-10]利用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面分析法分別對(duì)白斑狗魚魚肉和魚皮進(jìn)行分離純化，并研究了料液比、pH值、不同提取時(shí)間和溫度下，白斑狗魚魚肉和魚皮THA的變化，通過DSC法測(cè)得白斑狗魚魚肉的最佳THA達(dá)到0.061 2℃，白斑狗魚魚皮的最佳THA達(dá)到0.072 0℃。

2　昆蟲ISPs的抗凍活性檢測(cè)

昆蟲作為變溫動(dòng)物，其生長(zhǎng)發(fā)育要經(jīng)受冬季低溫的制約。昆蟲在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，已經(jīng)形成了一系列的適應(yīng)對(duì)策和抗寒機(jī)制。例如，有的昆蟲能夠忍受體內(nèi)結(jié)冰，有的通過降低過冷卻點(diǎn)和體內(nèi)含水量的方法越冬。其中，ISPs的產(chǎn)生是最為重要的低溫適應(yīng)策略之一。許多研究已經(jīng)表明，不僅在昆蟲的體液中，而且在昆蟲的腸液和細(xì)胞內(nèi)液中都有ISPs的產(chǎn)生。劉俊杰等人[11]研究甲蟲抗凍蛋白是一種具有規(guī)則結(jié)構(gòu)的昆蟲ISPs，在相同濃度條件下，利用DSC法對(duì)其ISPs進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其具有比魚類ISPs更高的抗凍活性。產(chǎn)生ISPs是寒帶昆蟲抵御低溫的重要機(jī)制之一，但檢測(cè)其活性仍存在一些困難，尤其對(duì)個(gè)體較小的昆蟲樣品。為了探索DSC法是否適于檢測(cè)昆蟲總蛋白的THA，崔寧寧等人[12]利用DSC法對(duì)黃粉蟲（Tenebrio molitor）幼蟲的總蛋白和血淋巴分別進(jìn)行了THA檢測(cè)。結(jié)果表明，黃粉蟲總蛋白的THA（0.49～0.98℃）要低于血淋巴（2.54～4.34℃）。通過這種方法，進(jìn)一步檢測(cè)了3種在內(nèi)蒙古大興安嶺林區(qū)采集到的越冬昆蟲：稠李巢蛾（Yponomeuta exonymallus）幼蟲、舞毒蛾（Lymantria dispar）卵和落葉松八齒小蠹（Isp subelongatus）成蟲。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們體內(nèi)都存在THA，其中稠李巢蛾的THA為（0.34～0.43℃），舞毒蛾的THA為（0.35～0.42℃），落葉松八齒小蠹的THA為（0.37～0.40℃），說明這3種昆蟲能以產(chǎn)生ISPs的方式作為越冬策略之一。研究表明，通過DSC法檢測(cè)昆蟲總蛋白是否存在THA來判斷ISPs的存在是可行的。Graether S P等人[13]研究發(fā)現(xiàn)，20 μmol/L的云杉卷葉蛾ISPs能降低冰點(diǎn)1.08℃，而美洲擬鰈（Pleuronectesamericanus）I型ISPs在濃度到達(dá)400 μmol/L時(shí)，僅使冰點(diǎn)降低0.27℃。Andrew J S等人[14]研究發(fā)現(xiàn)，黃粉蟲冰結(jié)構(gòu)蛋白（TmISP）濃度為20 mol/L時(shí)能使冰點(diǎn)降低1.4℃，而Ш型魚類（Oceanpout）ISPs的濃度為218 mol/L時(shí)才降低相同的冰點(diǎn)。這些差異既存在于分離的天然ISPs中，也存在于純化單一成分的重組ISPs或合成ISPs中，因此排除了在體外昆蟲ISPs活性的提高是由于其他成分加入的解釋[15]。用TmISP與含不同濃度該蛋白的昆蟲體液進(jìn)行Western Blot試驗(yàn)，結(jié)果表明THA與ISPs濃度之間的關(guān)系呈雙曲線型，并且在雙曲線斜率變化最大部分的濃度與昆蟲體內(nèi)ISPs的生理濃度非常吻合，這提示昆蟲體內(nèi)ISPs濃度較小的改變就會(huì)對(duì)其THA造成較大的影響[16]。

3　植物ISPs的抗凍活性檢測(cè)

到目前為止，被研究的植物材料多達(dá)40余種，現(xiàn)已陸續(xù)在冬小麥、燕麥、冬黑麥、黑麥草、歐白英、胡蘿卜、沙冬青、桃樹、唐古特紅景天、甜楊等至少26種高等植物中獲得具有抗凍活性的ISPs[17]。曲敏等人[1]利用磷酸鹽緩沖溶液法提取苜蓿蛋白，經(jīng)硫酸銨沉淀后，對(duì)其透析脫鹽、冷凍干燥復(fù)溶后進(jìn)行冰晶形態(tài)的觀察，可以看到冰晶體積小、數(shù)量多、形態(tài)多樣，說明苜蓿蛋白抑制冰晶生長(zhǎng)及對(duì)冰晶形態(tài)修飾效果顯著，具有較好的抗凍活性，為苜蓿ISPs。Chantelle J等人[18]發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)ISPs表現(xiàn)出2種類型的“防凍劑活動(dòng)”——熱滯現(xiàn)象（THA）和抑制冰重結(jié)晶活動(dòng)。檢測(cè)多年生黑麥草突變體ISPs抑制冰重結(jié)晶的活動(dòng)和熱滯現(xiàn)象的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)抑制冰重結(jié)晶的活動(dòng)和熱滯現(xiàn)象相關(guān)，并在突變體中觀察到了形狀各異的冰晶形態(tài)，能夠減少冷凍對(duì)細(xì)胞的破壞。龔束芳等人[19]以野生偃麥草為原料，選取各個(gè)季節(jié)的偃麥草根莖提取蛋白，在顯微鏡下進(jìn)行觀察，觀察到冰晶修飾為六角形能力，說明其具有較好的抗凍活性。張超等人[20]以胡蘿卜AFP為研究對(duì)象，使用DSC法測(cè)定THA，對(duì)影響樣品THA的因素進(jìn)行全面考察，以建立一個(gè)有效測(cè)定THA的標(biāo)準(zhǔn)方法。其中，主要研究樣品濃度、升降溫速率，冰晶含量等因素對(duì)樣品THA的影響，并考察了該方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性和精確度。結(jié)果表示，DSC法可以有效地用于樣品THA測(cè)定。田童童等人[21]在此基礎(chǔ)上，使用DSC法測(cè)定胡蘿卜ISPs的THA。分別對(duì)樣品質(zhì)量濃度、升降溫速率、冰晶含量等有可能影響其THA的主要因素進(jìn)行研究，試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著原料質(zhì)量濃度的升高，THA也逐漸的升高；當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.5 mg/mL，THA趨向于穩(wěn)定。緩慢的升溫和降溫過程導(dǎo)致儀器檢測(cè)的靈敏度降低，從而導(dǎo)致未能檢出THA，由此確定了測(cè)定ISPs的THA升降溫速率為1℃/min。當(dāng)樣品中冰晶含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于1%時(shí)，THA會(huì)以冪指函數(shù)的形式上升，進(jìn)一步增加樣品中的冰晶含量，THA將會(huì)穩(wěn)定在某一個(gè)數(shù)值。因此，原料質(zhì)量濃度、升降溫速率、冰晶含量等條件的改變對(duì)THA的檢測(cè)有影響，但目前通過改變條件進(jìn)行THA檢測(cè)的研究較少，只是單一的測(cè)定其THA值。劉尚等人[22]根據(jù)ISPs與冰結(jié)合的特性，利用碎冰從女貞（Ligustrum lucidum）葉提取液中分離出抗凍蛋白，利用DSC法對(duì)其進(jìn)行THA測(cè)定。結(jié)果表明，在0.5 mg/mL的濃度下，冰晶含量為7%時(shí)，THA值為0.678℃，說明冰提法提取的女貞葉ISPs抗凍活性較高，接近于魚類抗凍蛋白。尉姍姍等人[23]利用纖維素DE-52離子柱層析提取分離出了冬季新疆沙冬青（Ammopiptanthus nanus）葉片中的ISPs，用DSC法測(cè)定結(jié)果表明，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)，ISPs的THA為0.46℃。金濤等人[24]利用真空滲透離心法，提取燕麥ISPs工藝的研究，經(jīng)優(yōu)化提取工藝所得到的燕麥質(zhì)外體蛋白質(zhì)經(jīng)DSC檢測(cè)，THA為2.07℃，證明所得蛋白具有明顯的熱滯活性。

4　細(xì)菌與真菌ISPs的抗凍活性檢測(cè)

目前，細(xì)菌、真菌中分離提純的ISPs種類非常少，僅在南極和北極的少量菌株中發(fā)現(xiàn)ISPs。James A.Raymond等人發(fā)現(xiàn)香菇、金針菇，以及一些深海冰川中的細(xì)菌和硅藻中含有ISPs，并且觀察到了形狀各異的冰晶形態(tài)。也有報(bào)道稱，冬菇（Flammulina velupites）和牡蠣菇（Pleurotus ostreatus）中存在ISPs[25]。

綜上，冰晶和THA是反映冰結(jié)構(gòu)蛋白抗凍活性的2個(gè)重要指標(biāo)，分別從修飾冰晶形態(tài)和降低冰點(diǎn)提高熱滯差值2個(gè)不同層面反應(yīng)了冰結(jié)構(gòu)蛋白的抗凍活性。一種冰結(jié)構(gòu)蛋白的冰晶形態(tài)特點(diǎn)和THA相互關(guān)聯(lián)。對(duì)冰結(jié)構(gòu)蛋白的冰晶觀察操作簡(jiǎn)單、冰晶形態(tài)直觀性強(qiáng)、判斷迅速；而對(duì)利用DSC檢測(cè)則準(zhǔn)確反映其冰點(diǎn)溫度和熔點(diǎn)溫度的差異（THA），冰晶含量分析準(zhǔn)確。因此，在研究冰結(jié)構(gòu)蛋白的抗凍活性時(shí)應(yīng)從這2個(gè)方面進(jìn)行檢測(cè)鑒定，建立其抗凍活性的聯(lián)合檢測(cè)機(jī)制。

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Advances in Detection of Thermal Hysteresis Activity of Ice Structuring Proteins

CHEN Fenglian，BAO Huan，*QV Min，LI Lingli
（College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，College and Vniversties in Heilongjiang Province Key Laboratory of Food Science and Eugineering，Harbin，Heilongjiang 150076，China）

Abstract：In recent years，antifreeze activity detection researched on marine fish，insects，plants，bacteria and fungi.Two kinds of detection method that are ice crystals and thermal hysteresis activity carried on the comprehensive review.Finally，the prospects is put forward to establish joint detection of antifreeze activity of ice structural protein by ice crystal observation and thermal hysteresis activity by differential scanning calorimetry.

Key words：ice structuring proteins；ice crystals；thermal hysteresis activity

中圖分類號(hào)：TS255.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.02.045

文章編號(hào)：1671-9646（2016）02b-0056-03

收稿日期：2015-12-21

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C2011-24）；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（12511128）；黑龍江省博士后科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（LBH-Q13098）；2014年哈爾濱商業(yè)大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目（YJSCX2014-334HSD）。

作者簡(jiǎn)介：陳鳳蓮（1975—），女，博士，副教授，研究方向?yàn)榧Z食谷物及其副產(chǎn)品精深加工。

*通訊作者：曲敏（1966—），女，博士，教授，研究方向?yàn)槭称返鞍着c添加劑。