楊偉 李增彩 倪秀瑩 王濤

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乙型肝炎病毒X區(qū)基因變異與原發(fā)性肝癌的關(guān)系研究

楊偉 李增彩 倪秀瑩 王濤

【摘要】目的 初步研究乙型肝炎病毒（HBV）X區(qū)基因變異與原發(fā)性肝癌的關(guān)系。方法 收集39例HBV感染患者的肝（癌）石蠟組織標(biāo)本，其中慢性乙型肝炎（CHB）14例、肝細(xì)胞癌（HCC）25例。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法擴(kuò)增組織中HBVX區(qū)基因，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序，分析常見變異位點(diǎn)的變異情況。結(jié)果 1. HCC組與CHB組相比，在X區(qū)發(fā)生插入/缺失變異，聯(lián)合變異的位點(diǎn)及例數(shù)增多，并且A1762 T與G1764 A常發(fā)生雙突變。2. HBVX區(qū)變異頻率較高位點(diǎn)依次是C1655 T/G、A1605 C/G、A1762 T、G1764 A、A1772B、A1645 C、C1687 A、G1776 T。結(jié)論 HBVX區(qū)存在點(diǎn)突變、插入/缺失變異及聯(lián)合變異，可能在HCC的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。

【關(guān)鍵詞】原發(fā)性肝癌；HBVX基因；變異

肝細(xì)胞癌（HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，乙型肝炎病毒（HBV）的慢性感染是其最重要因素。研究資料證明HBVX區(qū)病毒變異與HCC發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。本研究對慢性HBV感染者，其中慢性乙型肝炎（CHB）14例、HCC25例，共39例石蠟組織標(biāo)本的HBVX區(qū)基因變異情況進(jìn)行檢測，以初步探討HBVX區(qū)基因變異與HCC的關(guān)系。

資料和方法

一、標(biāo)本來源及分組

收集39例慢性HBV感染者肝（癌）組織標(biāo)本，其中CHB組肝組織14例、HCC組肝癌組織25例。

二、主要儀器和試劑

PCR擴(kuò)增儀：雙螺旋牌PTC-51 DNA溫度循環(huán)器（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)所總后勤部衛(wèi)生部監(jiān)制），PCR擴(kuò)增試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司，DL2000 DNAMarker購自日本Ta KaRa公司。

三、石蠟組織中HBVDNA提取

采用傳統(tǒng)的酚-氯仿提取法，提取后置-20℃冰箱保存。除了石蠟組織樣品外，每次提取過程都以1份雙蒸水樣品，作為全程的污染監(jiān)控。所有離心過程都在室溫下進(jìn)行。

四、引物的設(shè)計(jì)合成及PCR反應(yīng)體系

從Pub Med GenBank上下載兩條我國常見的B和C基因型的基因序列（ayr基因型，序列號為X04615和NC-003977），通過查閱文獻(xiàn)資料和應(yīng)用VectorNTISuite8.0軟件對基因序列多態(tài)性進(jìn)行分析，找出X區(qū)保守區(qū)序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)出針對HBVX基因序列特異的引物，并在blast上比對，最終篩選出如下引物序列。上游引物：5＇-TGTGCACTTCGCTTCACCTCT-3＇，下游引物：5＇-AGACCAATTTATGCCTACAGC-3＇，并委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。目的基因位于nt1578-1800，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為223 bp。PCR反應(yīng)體系：在50μL反應(yīng)體系中，加入2×PCRMaster緩沖液25μL（內(nèi)含10 MMTris -HCl、PH8.4的50 MMKCl、1.6 MMMgCl2）、上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、模板1.0μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，在94℃變性60 s、51℃退火60 s、72℃延伸60 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10 min。最后在-20℃冰箱保存。

五、產(chǎn)物測序及序列分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后直接測序，為保證測序結(jié)果的可靠性，測序采用正反雙向測序。測序結(jié)果應(yīng)用BioEdit7.0、Clustal W軟件與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比較，同時(shí)在http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上進(jìn)行比對，測序工作由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用χ2檢驗(yàn)。

結(jié)　果

一、X區(qū)基因擴(kuò)增情況

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0％瓊脂糖凝膠電泳觀察（圖1），結(jié)果顯示HCC組20例（20/25）與CHB組5例（5/14），共25例擴(kuò)增出與設(shè)計(jì)的目的基因長度一致的特異性片段，兩組目的基因擴(kuò)增陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

二、HCC組和CHB組HBVX區(qū)基因點(diǎn)突變情況（見表1）。

表1　25例標(biāo)本HBVX區(qū)基因變異情況

對擴(kuò)增25例標(biāo)本進(jìn)行測序，共發(fā)現(xiàn)71個(gè)位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變，前8位變異最多的位點(diǎn)及突變例數(shù)依次為：C1655 T/G（25例）、A1605 C/G（20例）、A1762 T（18例）、G1764 A（14例）、A1772B（12例）、A1645 C（10例）、C1687 A（10例）、G1776 T（10例）。25例均存在C1655 T/G變異，20例合并A1605 C/G變異，18例合并BCP區(qū)熱點(diǎn)雙突變A1762 T/G1764 A。HCC組在突變位點(diǎn)和例數(shù)方面均較CHB組多，且常發(fā)生A1762 T與G1764 A雙突變。

三、HCC組和CHB組HBVX區(qū)基因插入/缺失變異的情況

HCC組發(fā)現(xiàn)有18例（18/25）存在插入/缺失變異情況，分別為nt1641-1644缺失1個(gè)C、nt1633-1636間缺失GG、nt1647-1648間插入1個(gè)A、nt1676-1677間插入1個(gè)T、nt1678-1681間缺失AA、nt1731-1735間缺失1個(gè)C、nt1739-1742間缺失1個(gè)A；CHB組僅有2例（2/14）發(fā)現(xiàn)缺失變異，分別為nt1680缺失A、nt1622-1625缺失1個(gè)A。HCC組發(fā)生插入/缺失變異的例數(shù)及變異位點(diǎn)明顯多于CHB組。

四、HCC組和CHB組聯(lián)合變異的情況

聯(lián)合變異存在從四聯(lián)到十聯(lián)不同程度的變化情況（見表2）。

表2　常見變異位點(diǎn)在12例標(biāo)本中聯(lián)合變異的情況

討　論

肝癌是最常見惡性腫瘤之一，HBV病毒的慢性感染是肝癌的最重要因素。研究資料證明HBVX區(qū)病毒基因變異與HCC發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，但各項(xiàng)研究尚無統(tǒng)一的觀點(diǎn)和結(jié)果。我們所擴(kuò)增的基因序列位于HBVX區(qū)的nt1587-1800區(qū)段，該區(qū)段包含多個(gè)HBVDNA復(fù)制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)元件：BCP（ntl742-1849）、CURS（nt1643-1742）、NRE（ntl457-1628）和EnhⅡ（ntl627-1774）［1］。

在成功測序的25例標(biāo)本（HCC組20例、CHB組5例）中，均存在C1655 T/G變異，另外有20例發(fā)生A1605 C/G變異，推測這兩個(gè)位點(diǎn)變異可能在HBV感染的早期便會發(fā)生，而與HCC的發(fā)生和發(fā)展無密切關(guān)系。變異例數(shù)前8位位點(diǎn)依次為：C1655 T/G、A1605 C/G、A1762 T、G1764 A、A1772B、A1645 C、C1687 A、G1776 T。BCP區(qū)基因變異A1762 T、G1764 A通常以雙突變的形式存在，是目前的研究熱點(diǎn)。大量研究證明，該雙突變不僅與肝臟炎癥壞死和纖維化有關(guān)，還與HCC密切相關(guān)。一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)A1762 T/G1764 A雙突變在HCC組與非HCC組有明顯差異［2，3］；也有學(xué)者持不同意見，認(rèn)為BCP區(qū)雙突變在HBV慢性感染者中與肝纖維化的進(jìn)展有關(guān)，而不是與HCC有關(guān)，我們的研究較支持后一觀點(diǎn)。

既往研究發(fā)現(xiàn)nt1772鄰邊位點(diǎn)常發(fā)生插入/缺失變異［4，5］。本研究25例HCC組發(fā)現(xiàn)有9例存在插入/缺失變異情況，而14例CHB組僅有3例發(fā)現(xiàn)缺失變異。大量的研究資料顯示缺失變異常發(fā)生于羧基端如nt1763-1770、ntl770-1777、ntl753-1772、nt1750-1770等部位的缺失，這些突變能夠降低HBV的復(fù)制水平，與HBs Ag陽性、HBeAg陰性的無癥狀攜帶現(xiàn)象密切相關(guān)［6］。X區(qū)的插入/缺失變異可能與疾病的進(jìn)展有關(guān)，Seoung-Ae Lee等發(fā)現(xiàn)缺失/插入變異在肝硬化、HCC比CHB、乙型肝炎病毒攜帶者明顯增高，且均伴隨BCP雙突變［7］。X區(qū)發(fā)生插入/缺失變異后將產(chǎn)生移碼變異，使HBs Ag發(fā)生改變，喪失對細(xì)胞增殖抑制作用，導(dǎo)致肝細(xì)胞過度增生發(fā)生癌變。

HBVX區(qū)基因不但可以在自己區(qū)域內(nèi)發(fā)生聯(lián)合變異，還可以與其他開放讀碼框內(nèi)的位點(diǎn)發(fā)生聯(lián)合變異，本研究中表2也證實(shí)了這點(diǎn)。25例標(biāo)本中的熱點(diǎn)變異位點(diǎn)存在從四聯(lián)到十聯(lián)不同程度的聯(lián)合變異，HCC組在突變例數(shù)及聯(lián)合變異的位點(diǎn)數(shù)目方面均較CHB組多，在所有發(fā)生聯(lián)合變異的標(biāo)本中有7例合并BCP區(qū)熱點(diǎn)雙突變A1762 T/G1764 A。一項(xiàng)Meta分析顯示BCP區(qū)雙突變在HCC患者較非HCC患者明顯增高，若聯(lián)合EnhII/BCP其他變異位點(diǎn)如C1653 T、T1753 V，則這種差異更加顯著，而且是肝癌發(fā)生的早期事件；而C1653 T、T1753 V可能是肝癌發(fā)生的晚期事件［8］。HBV相關(guān)性肝癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，既往研究比較局限于單一位點(diǎn)變異的作用，近年來大家更注重多基因位點(diǎn)、多區(qū)域片段聯(lián)合變異所造成的影響，這也許能更全面地研究和發(fā)現(xiàn)HBV基因變異在HCC中的作用。

參 考 文 獻(xiàn)

1 朱榮.慢性乙型肝炎組織病理學(xué)指標(biāo)及病毒X基因變異與患者預(yù)后的相關(guān)性研究.上海：復(fù)旦大學(xué)，2006.

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6 謝佳新，殷建華，何永超，等.乙型肝炎病毒基因變異及其臨床意義.中華疾病控制雜志，2009，13：358-361.

7 Lee SA，Mun HS，Kim H，et al. Naturally occurring hepatitis Bvirus Xdeletions and insertions a Mong Korean chronic patients.JMed Virol，2011，83：65-70.

8 Liu S，Zhang H，Gu C，et al. Associations between hepatitis Bvirus Mutations and the risk of hepatocellular carcino ma：a meta-analysis. JNatl Cancer Inst，2009，101：1066-1082.

（本文編輯：易玲）

收稿日期：（2015-05-13）

作者單位：261021 山東省濰坊市第八九醫(yī)院傳染科