金宇霆 李大偉 明雅南 張江 張明 夏強

?

對乙酰氨基酚肝損傷時炎性因子、趨化因子以及Toll樣受體表達的動態(tài)變化

金宇霆 李大偉 明雅南 張江 張明 夏強

【摘要】目的 研究對乙酰氨基酚（APAP）引起肝臟組織損傷過程中的炎性因子、趨化因子以及Toll樣受體的動態(tài)變化。方法 隨機將30只小鼠分為6組：對照組、APAP1 h組、APAP3 h組、APAP6 h組、APAP12 h組，APAP24 h組，每組5只。禁食15 h后，對照組小鼠腹腔注射0.9％氯化鈉溶液，其余5組腹腔注射APAP300 Mg/kg誘發(fā)小鼠肝損傷。取各組小鼠肝臟組織采用實時PCR檢測炎性因子、趨化因子以及Toll樣受體的MRNA水平，HE染色觀察各組肝臟組織損傷情況。結(jié)果 與正常對照組相比，24 h內(nèi)APAP誘發(fā)的小鼠肝損傷隨時間推移加重。IL-6、IL-10、IL-1β、IP-10 MRNA相對于對照組在不同時間點有不同程度升高；MIP-3α 24 h相較對照組明顯下降（P＜0.05）；IFN-γ和TNF-α各時間點變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義。趨化因CXCR-2和CCR-2在24 h與對照組比較明顯下降（P＜0.05）；CXCL-2分別在12 h 和24 h升高14.8倍（P＜0.05）和7.8倍（P＜0.05）。Toll樣受體TLR-9、TLR-4相對對照組在不同時間點亦有不同程度升高或降低。結(jié)論 對乙酰氨基酚誘導(dǎo)肝損傷后，肝組織炎性因子、趨化因子及Toll樣受體MRNA表達水平發(fā)生明顯改變。

【關(guān)鍵詞】對乙酰氨基酚；炎癥因子；趨化因子；Toll樣受體

治療劑量的對乙酰氨基酚（APAP）是一種安全有效的止痛和退燒藥物。但是，過量使用APAP能導(dǎo)致以肝小葉中央纖維化為特點的急性肝衰竭。近幾十年來，APAP引起的急性肝損傷已經(jīng)成為急性肝衰竭的主要原因［1］。APAP在肝細胞內(nèi)經(jīng)過CYP450代謝轉(zhuǎn)化成N-乙酰-對苯醌亞胺（N-acetyl-p-benzoquinone Imine，NAPQI）。NAPQI可與胞內(nèi)親核物質(zhì)結(jié)合進入細胞核，產(chǎn)生肝細胞毒性［2］。正常情況下NAPQI通過結(jié)合谷胱甘肽解毒，所以谷胱甘肽耗竭在肝臟損傷進展過程發(fā)揮重要的作用。有學(xué)者認為，APAP誘導(dǎo)急性肝損傷的病理生理過程主要是代謝產(chǎn)物激活、谷胱甘肽消耗和蛋白結(jié)合［3］。APAP肝損傷與肝細胞線粒體功能障礙，自由基代謝產(chǎn)物增加以及氧化應(yīng)激等有密切關(guān)聯(lián)［4］。近年的研究發(fā)現(xiàn)，固有免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)在APAP誘導(dǎo)的肝損傷也起重要作用［5］。本研究觀察APAP誘導(dǎo)的肝損傷小鼠模型病理生理過程中炎性因子、趨化因子及Toll樣受體的動態(tài)變化，為進一步理解APAP肝損傷機制提供科學(xué)依據(jù)。

資料和方法

一、實驗動物與主要試劑及儀器

（一）實驗動物 雄性C57BL/6小鼠，鼠齡8～10周，體質(zhì)量20～25 g，無固定病原體級（SPF），購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心。小鼠均于清潔環(huán)境下晝夜規(guī)律喂養(yǎng)，自由進食、飲水。

（二）試劑及儀器 APAP購自美國Sig ma公司；TLR-9、TLR-4、CXCL-2、CXCR-2、MIP-3a、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、CCR-2、IL-6、IL-10、IP-10引物購自日本Ta KaRa公司；SYBR購自日本Ta KaRa公司；TRIZOL購自美國Invitrogen公司；徠卡顯微鏡購自德國徠卡儀器有限公司；Minispin臺式高速離心機購自德國Eppendorf公司；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；微量加樣器購自德國Eppendorf公司。

二、動物分組及模型的制備

采用隨機數(shù)表法將30只小鼠，每組5只，分為6組：對照組、APAP1 h組、APAP3 h組、APAP6 h組、APAP12 h組，APAP24 h組。所有小鼠注射APAP溶液之前禁食15 h。實驗組小鼠腹腔注射對乙酰氨基酚溶液300 Mg/kg，對照組小鼠腹腔注射0.9％氯化鈉溶液，注射對乙酰氨基酚溶液后恢復(fù)正常食物供應(yīng)。

三、檢測指標

（一）小鼠肝臟炎性因子、趨化因子和Toll樣受體MRNA肝臟RNA提取及實時定量（qRT）PCR分析MRNA表達水平?？俁NA根據(jù)制造商提供的步驟用Trizol（購自美國Invitrogen）法提取。所提取的總RNA用分離光度計測定RNA在260 nm處的吸光度，以A260 nm/A280 nm評估提取的總RNA的濃度和質(zhì)量。選取A260 nm/A280 nm在1.9～2.0之間的樣品用于qRT-PCR分析。然后將所提RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR用20μL體系包括cDNA，SYBRGreen PCR混合液（購自日本Takara公司）水及引物（購自上海皓嘉生物公司），反應(yīng)條件為95℃，酶活化15 min；95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min，一共40個循環(huán)。

（二）小鼠肝組織HE染色 小鼠肝臟組織取肝左外葉和右外葉，用體積分數(shù)為0.04甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片（厚5μm），HE染色，于顯微鏡下觀察肝組織病理改變。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS軟件（19.0版）進行統(tǒng)計處理，組間均數(shù)的比較采用方差分析（ANOVA）或者Kruskal-Wallis檢驗，并使用Dunnett t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　果

一、APAP肝損傷組織病理形態(tài)學(xué)影響

給予APAP后不同時間點肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果如圖1所示。隨著時間推移，肝組織壞死情況逐漸加重，SUZUKI評分增高。對照組：肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝細胞未見變性、壞死；APAP1 h組：肝小葉結(jié)構(gòu)尚清楚，可見中央靜脈周圍少量肝細胞胞質(zhì)氣球樣變；APAP3 h組：肝小葉結(jié)構(gòu)尚可見，可見點片狀壞死，肝細胞氣球樣變明顯增加，肝竇充血可見；APAP6 h組：肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，可見較大面積細胞壞死，大量肝細胞水腫及炎性細胞浸潤改變；APAP12 h組：肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，大片狀細胞壞死，肝竇充血明顯；APAP24 h組：肝小葉結(jié)構(gòu)明顯破壞，大面積細胞壞死，明顯炎性細胞浸潤。

二、APAP肝損傷肝組織中Toll樣受體MRNA水平變化

由圖2 A可見，與對照組相比，APAP300 Mg/kg誘導(dǎo)的肝損傷組織TLR-9 MRNA在1 h升高4.6倍（P＜0.05），之后開始下降，在3 h降到2.6倍（P＜0.05），并于6 h恢復(fù)正常水平。TLR-4（圖2B）在3 h降到對照組的25％（P＜0.05），直至24 h尚未恢復(fù)正常水平。

三、APAP肝損傷肝組織中趨化因子MRNA水平變化

IP-10（圖2 C）在6 h開始升高至對照組的13.5倍（P＜0.05），12 h為4.3倍（P＜0.05），并于24 h恢復(fù)正常。CXCL-2（圖2 D）表達水平與對照組相比，在前6 h變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義，于12 h和24 h分別升高14.8倍（P＜0.05）和7.8倍（P＜0.05）。CXCR-2（圖2 E）表達水平在24 h降至對照組的39％（P＜0.05），24 h前表達變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義。CCR-2（圖2F）表達水平與對照組比較，3 h降到30％（P＜0.05），且3 h至24 hCCR-2表達變化程度組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

四、APAP肝損傷肝組織中炎性因子MRNA水平變化

IL-6（圖3 A）3 h表達水平相較于對照組升高2.6倍（P＜0.05），其他時間點變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義。IL-10（圖3B）跟對照組相比，在1 h、3 h、6 h分別升高2.5倍、2.4倍、2.1倍（P＜0.05），12 h恢復(fù)正常水平，24 h降至52％（P＜0.5）。由圖3 C可見，IL-1β表達水平1 h升高2倍（P＜0.05），其他時間點與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組相比，MIP-3α（圖3F）24 h表達水平下降至23％（P＜0.05），其他時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義。TNF-α（圖3 D）與IFN-γ（圖3 E）相較于對照組，在各時間點的變化皆差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

討　論

APAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷與臨床肝損傷病理過程極為相似，本實驗通過各個時間點的肝臟HE染色來觀察24 h內(nèi)APAP誘導(dǎo)肝損傷進展情況，并采用qRT-PCR檢測各時間點肝臟組織的炎性因子、趨化因子及Toll樣受體MRNA表達水平的變化，以研究APAP肝損傷病理過程固有免疫所發(fā)揮的作用。

圖1　對乙酰氨基酚作用不同時間對肝組織的影響

圖2　Toll樣受體和趨化因子MRNA相對表達量

目前認為，無菌性炎性反應(yīng)和固有免疫細胞參與APAP誘導(dǎo)的肝損傷和修復(fù)，而相較肝臟缺血再灌注損傷、梗阻性膽汁淤積和內(nèi)毒素血癥的病理生理過程，炎性細胞對APAP肝毒性的作用是矛盾的。APAP肝毒性反應(yīng)被認為最初是由NAPQI啟動。超劑量應(yīng)用APAP時，人體內(nèi)葡萄糖醛酸化和硫酸鹽化作用負載過重，且谷胱甘肽過度消耗，過量的NAPQI共價結(jié)合半胱氨酸家族形成APAP蛋白加合物，激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致線粒體功能失調(diào)和DNA損傷，最后介導(dǎo)肝細胞壞死。谷胱甘肽和共價結(jié)合是APAP肝毒性的先決條件。然而，肝損傷的嚴重程度卻取決于下游的炎性細胞因子釋放。APAP誘導(dǎo)的肝細胞壞死可激活固有免疫細胞及募集炎性細胞，而固有免疫細胞釋放的炎性介質(zhì)，如炎性因子、趨化因子、氧自由基等，參與肝臟損傷的進展。

圖3　炎性因子MRNA相對表達量

庫普弗細胞是定位于肝臟的具有噬菌作用的巨噬細胞，具有多重功能，如吞噬作用、內(nèi)吞作用、免疫調(diào)節(jié)作用、合成和分泌各種生物活性介質(zhì)。研究表明［6］，TLR-4基因敲除的小鼠對APAP肝毒性更加敏感。本實驗結(jié)果顯示，TLR-4 MRNA水平在APAP腹腔注射后3 h，下降到對照組的25％，直至24 h未恢復(fù)正常。同時還發(fā)現(xiàn)TLR-9在1 h就開始明顯升高，6 h才恢復(fù)正常水平。TLR-9可被APAP肝損傷的壞死細胞產(chǎn)生的DNA激活，協(xié)同Nalp3促進IL-1β生成。而IL-1β則是一種非常重要的促炎性因子，本實驗中IL-1β在1 h升高了2倍，說明IL-1β參與APAP肝損傷早期的炎性反應(yīng)。

有文獻表明［7］，IFN-γ基因敲除小鼠對APAP肝毒性敏感性明顯降低。APAP誘導(dǎo)肝損傷情況下庫普弗細胞激活產(chǎn)生的TNF-α表達量升高［5，7］。然而本實驗結(jié)果表明，IFN-γ和TNF-α在APAP誘導(dǎo)肝損傷肝組織的MRNA表達量在各時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義。IL-6和IL-10對APAP引起的肝損傷有明顯的保護作用。Masubuchi等［8］研究發(fā)現(xiàn)，IL-6基因敲除的小鼠肝細胞內(nèi)的熱休克蛋白缺乏，導(dǎo)致機體對APAP肝毒性更加敏感。本研究結(jié)果表明，IL-6和IL-10 MRNA分別在APAP誘導(dǎo)肝損傷后3 h和1 h開始升高，與文獻報道較為一致［9］。趨化因子募集炎性細胞，參與APAP肝臟毒性過程，MCP-1、MIP-1α、MIP-2及IP-10在應(yīng)用APAP的動物模型的肝臟組織明顯上調(diào)表達［10］。趨化因子對于APAP肝損傷的作用充滿爭議，一些學(xué)者認為趨化因子通過增強炎性細胞遷移促進肝損傷，然而也有部分研究認為趨化因子具有對抗肝損傷的作用，這類保護作用依靠浸潤的炎性細胞釋放抗炎細胞因子以及直接刺激肝細胞增生實現(xiàn)。趨化因子CCR-2，CXCR-2保護APAP肝損傷，CCR-2是MCP-1的受體，小鼠敲除CCR-2基因后，APAP肝毒性損傷加重，且與損傷相關(guān)的肝臟IFN-γ和TNF-α表達升高［11，12］。本研究結(jié)果顯示，CXCL-2相對于對照組在12 h和24 h分別升高14.8倍和7.8倍，CCR-2和CXCR-2則是在各自時間點有不同程度下降。

APAP誘導(dǎo)肝臟毒性反應(yīng)是個非常復(fù)雜的過程，多種細胞及生物活性物質(zhì)參與其中。固有免疫系統(tǒng)對于APAP肝損傷是重要的參與者。本研究討論了炎性因子、趨化因子和Toll樣受體在APAP肝損傷病理生理過程的動態(tài)變化，證實了固有免疫系統(tǒng)在APAP肝損傷的重要作用，為進一步研究固有免疫與APAP肝損傷之間的聯(lián)系以及闡明APAP肝損傷的具體機制提供借鑒。

參 考 文 獻

1 Cooper SC，Aldridge RC，Shah T，et al. Outcomes of liver transplantation for paraceta Mol（aceta minophen）-induced hepatic failure. Liver Transpl，2009，15：1351-1357.

2 Ren SG，Malozowski S，Sanchez P，et al. Direct ad ministration of testosterone increases rat tibial epiphyseal growth plate width. Acta Endocrinol，1989，121：401-405.

3 Mitchell JR，Jollow DJ，Potter WZ，et al. Aceta minophen-induced hepatic necrosis. I. Role of drug metabolism. JPharmacol Exp Ther，1973，187：185-194.

4 Saini SP，Zhang B，Niu Y，et al. Activation of liver Xreceptor increases aceta minophen clearance and prevents its toxicity in mice. Hepatology，2011，54：2208-2217.

5 Jaeschke H. Role ofinflam mation in the mechanism of acetaminopheninduced hepatotoxicity. Expert Opin Drug Metab Toxicol，2005，1：389-397.

6 Laskin DL，Pilaro AM，Ji S.Potentialrole of activated macrophagesin aceta minophen hepatotoxicity. II. Mechanism of macrophage accu Mulation and activation. Toxicol Appl Pharmacol，1986，86：216-226.

7 Ishida Y，Kondo T，Ohshima T，et al. Apivotal involvement of IFN-ga Mma in the pathogenesis of aceta minophen-induced acute liver injury. FASEBJ，2002，16：1227-1236.

8 Masubuchi Y，Bourdi M，Reilly TP，et al. Role ofinterleukin-6 in hepatic heat shock protein expression and protection against aceta minophen-induced liver disease. Biochem Biophys Res comMun，2003，304：207-212.

9 Bourdi M，Masubuchi Y，Reilly TP，et al. Protection against aceta minophen-induced liver injury and lethality by interleukin 10：role of inducible nitric oxide synthase. Hepatology，2002，35：289-298.

10 Gardner CR，Laskin JD，Dambach DM，et al. Exaggerated hepatotoxicity of aceta minophen in mice lacking tu Mor necrosis factor receptor-1. Potential role of infla Mmatory mediators. Toxicol Appl Pharmacol，2003，192：119-130.

11 Bone-Larson CL，Hogaboam CM，Evanhoff H，et al. IFN-gam mainducible protein-10（CXCL10）is hepatoprotective during acute liver injury through the induction of CXCR2 on hepatocytes. JIm Munol，2001，167：7077-7083.

12 Hogaboam CM，Bone-Larson CL，Steinhauser ML，et al.Exaggerated hepatic injury due to aceta minophen challenge in mice lacking C-Cchem okine receptor 2. AMJpathol，2000，156：1245-1252.

（本文編輯：錢燕）

·臨床與基礎(chǔ)研究·

Dynamic variation of inflam matory cytokines，chemokines and Toll-like receptors in APAP-induced liver injury

JINYu-ting，LIDa-wei，MINGYa-nan，ZHANGJiang，ZHANGMing，XIAQiang. Department of Liver Surgery，RenJi Hospital，ShanghaiJiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200127，China

【Abstract】Objective To explore the dynamic changes ofinflam matory cytokines，chem okines and Toll-like receptors （TLR）in acetaminophen（APAP）-induced liver injury within 24 hours. Methods C57BL/6 mice were rando mly divided into six groups：control group，APAP1h group，APAP3h group，APAP6h group，APAP12h group and APAP24h group，including 5 mice in each group. After fasting for 15 hours，control group were given 0.9％saline by intraperitoneal injection，w hile other groups were given 300 Mg/kg APAP. Assessment of the various inflam matory cytokines，chem okines and TLRin mice liver was carried out at MRNAlevel by realtime poly merase chain reaction（RT-PCR）. Degrees of APAP-induced liver injury were evaluated by haematoxylin eosin（HE）staining. Results According to HEstaining result，APAP-induced liver injury in APAPgroups increasingly aggravated within 24 hours w hen compared with that in control group.In APAPgroups，RT-PCRindicated that MRNAlevels of IL-6，IL-10，IL-1βand IP-10 rose to various degrees at different time points，w hile MIP-3α MRNAlevels declined distinctly（P＜0.05），w hich was in contrast to control group. Additionally，variation ofinterferon（IFN）-γ and tu Mor necrosis factor（TNF）-α had no statistical difference between APAPand control groups.In APAPgroups，levels of CXCR-2 and CCR-2 were obviously lower at 24h（P＜0.05）than those in control group，w hile level of CXCL-2 rose to 14.8 and 7.8 times higher at 12h and 24h（P＜0.05），respectively. Furtherm ore，levels of TLR-9 and TLR-4 changed to various extents at different time points（P＜0.05）. Conclusion APAPfor 300 Mg/kg induces mice liver injury within 24h，w hich makes inflam matory cytokines，chem okines and TLRchange obviously at MRNAlevels in mice liver.

【Key words】Acetaminophen；Cytokine；Chem okine；Toll-like receptor

收稿日期：（2015-08-31）

Corresponding author：XIAQiang，Email：xiaqiang@medmail.com.cn

通信作者：夏強，Email：xiaqiang@med mail.com.cn

基金項目：國家自然基金項目（81472243）；上海市衛(wèi)生局重點聯(lián)合攻關(guān)項目（2013ZYJB001）

作者單位：200127 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院肝臟外科（金宇霆，李大偉，張江，張明，夏強）；消化內(nèi)科（明雅南）