亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        血府逐瘀湯促血管新生中EphB4/ephrinB2信號(hào)通路的作用研究*

        2016-03-27 02:45:45許曉玲王一錚
        關(guān)鍵詞:含藥血府逐瘀湯內(nèi)皮細(xì)胞

        許曉玲,蔡 飛,林 凡,王一錚,高 冬△,宋 軍

        (1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,福州 350108;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,北京 100700)

        血府逐瘀湯促血管新生中EphB4/ephrinB2信號(hào)通路的作用研究*

        許曉玲1,蔡 飛1,林 凡1,王一錚1,高 冬1△,宋 軍2

        (1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,福州 350108;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,北京 100700)

        目的:探討EphB4/ephrinB2信號(hào)通路在血府逐瘀湯促血管新生中的作用。方法:運(yùn)用血清藥理學(xué)方法,以1.25%、2.5%、5%濃度的血府逐瘀湯含藥血清和空白血清干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC-12)48 h,通過(guò)MTT法、Boyden小室遷移法、細(xì)胞黏附法、逆轉(zhuǎn)錄PCR法分別檢測(cè)細(xì)胞增殖、遷移、黏附、EphB4和EphrinB2基因表達(dá)的情況。結(jié)果:與同血清含量的對(duì)照組比較,5%濃度含藥血清對(duì)細(xì)胞的增殖能力起抑制作用。1.25%、2.5%和5%3個(gè)濃度含藥血清皆有顯著的促內(nèi)皮細(xì)胞遷移和黏附作用,并能抑制EphB4的表達(dá),其中1.25%、2.5%濃度含藥血清抑制EphrinB2的表達(dá)。結(jié)論:血府逐瘀湯通過(guò)促內(nèi)皮細(xì)胞遷移和黏附發(fā)揮促血管新生作用,且該作用可能與EphB4/EphrinB2通路密切相關(guān)。

        血府逐瘀湯;EphB4/ephrinB2;血管新生

        血府逐瘀湯為清·王清任所創(chuàng)立的活血化瘀經(jīng)典方劑之一。該方配伍嚴(yán)謹(jǐn),活血藥與理氣藥并用,臨床防治心腦血管性疾病療效顯著。前期研究證實(shí),血府逐瘀湯具有較好的促血管新生作用,但具體作用機(jī)制復(fù)雜,呈多途徑、多靶點(diǎn)特征[1-4]。EphB4/ ephrinB2在調(diào)節(jié)血管生成方面受到越來(lái)越多的關(guān)注,其獨(dú)特的雙向信號(hào)在血管新生活動(dòng)包括內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、黏附、分化等過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用[4-5]。探索血府逐瘀湯如何通過(guò) EphB4/ ephrinB2信號(hào)通路發(fā)揮促血管新生調(diào)控作用,有助于為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支持。

        1 實(shí)驗(yàn)方法

        1.1 藥物制備

        血府逐瘀湯組成:當(dāng)歸9 g,生地9 g,桃仁12 g,紅花9 g,枳殼6 g,赤芍6 g,柴胡3 g,甘草6 g,桔梗4.5 g,川芎4.5 g,牛膝9 g。水煎服,每日2次。煎液過(guò)濾、混合后加熱濃縮至含生藥量1.3 g/mL,4℃保存?zhèn)溆?,藥物?gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂第二門診部。

        1.2 動(dòng)物分組及血清制備

        SD6周齡大鼠,體質(zhì)量(150±30)g,雌雄各半,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng),3 d適應(yīng)性喂養(yǎng)后按隨機(jī)數(shù)字表法分為藥物組(血府逐瘀湯組)和對(duì)照組(生理鹽水組)各20只。藥物組按13 g/k g(相當(dāng)于人臨床用量的10倍)劑量即10 mL/kg灌胃,對(duì)照組用等劑量生理鹽水,每天2次,連續(xù)灌胃7 d。于末次灌胃2 h后,采用10%水合氯醛麻醉,腹主動(dòng)脈取血,4000 r/min,離心30 min分離血清,56℃滅活30 min,0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3 試劑及設(shè)備

        DMEM高糖培養(yǎng)液和胎牛血清(美國(guó) Hyclone公司),MTT粉劑(美國(guó) Biosharp公司),Trizol(美國(guó)Invitrogen公司),Oligo D(t)18(大連寶生物),Taq DNA聚合酶(美國(guó)Fermentas公司),PCR Buffer(美國(guó)Fermentas公司),Goldview核酸染液(上海賽百盛生物有限公司),瓊脂糖(美國(guó) Sigma公司),Boyden小室(江蘇省海門市麒麟醫(yī)用儀器廠),IX70倒置相差顯微鏡及數(shù)碼攝像裝置(日本尼康公司),ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀 (美國(guó) BioTek公司),Barnstead純水系統(tǒng)(美國(guó) Thermo公司),Eppendorf高速臺(tái)式離心機(jī)和基因擴(kuò)增儀(德國(guó) Eppendorf公司),DYY-6C型電泳儀 和DYCP-3K型電泳槽(北京市六一儀器廠),SHP250型生化培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

        1.4 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及藥物誘導(dǎo)處理

        內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC-12購(gòu)于中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室,采用5%胎牛血清 DMEM培養(yǎng)液,以2.5× 105/mL密度進(jìn)行接種,25 cm2培養(yǎng)瓶接種量為每瓶1mL,于37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng),待5 h細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液隨機(jī)分成藥物組和對(duì)照組,藥物組換1.25%、2.5%、5%含藥血清的DMEM培養(yǎng)液,對(duì)照組分別換含等量對(duì)照血清的 DMEM培養(yǎng)液,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h備用。

        1.5 MTT實(shí)驗(yàn)

        培養(yǎng)在96孔板內(nèi)的HUVEC-12共計(jì)6組經(jīng)藥物和生理鹽水分別干預(yù)48 h后,每孔加入20 μL,5 mg/mL的MTT,孵育4 h后棄去培養(yǎng)液,每孔加入DMSO 200 μL,振蕩15 min后于酶標(biāo)儀檢測(cè)530 nm波長(zhǎng)的OD值,參比波長(zhǎng)630 nm。

        1.6 遷移實(shí)驗(yàn)

        收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清液于Boyden小室的下室,室間置以8 μm的聚碳酸酯膜,上室加入對(duì)應(yīng)組別的細(xì)胞2×104,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h,聚碳酸酯膜經(jīng)棉簽輕輕刮去上室面的細(xì)胞,中性甲醛固定下室面的細(xì)胞,蘇木素常規(guī)染色,高倍視野(200×)隨機(jī)計(jì)數(shù)下室面12個(gè)視野下的細(xì)胞個(gè)數(shù)。

        1.7 黏附實(shí)驗(yàn)

        收集各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,以9×103/孔細(xì)胞數(shù)種入96孔板,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 min,PBS洗去未貼壁的細(xì)胞,每孔加入200 μL中性甲醛固定20 min,100 μL/孔蘇木素常規(guī)染色15 min,蒸餾水洗去染液后于200倍鏡下進(jìn)行觀察(每孔在固定位置取10個(gè)視野)。

        1.8 RT-PCR(兩步法)Trizol法提取

        表1顯示,HUVEC-12細(xì)胞內(nèi)總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。EphB4、EphrinB2和βactin基因序列從 PUBMED的 Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得,由大連寶生物公司設(shè)計(jì)并合成。反應(yīng)體系為10 × Taq buffer5 μL,25mmolMgCl26 μL,10mmmoldNTP 1 μL,模板1.2 μL,1U/μL TaqDNA聚合酶2 μL,10 μmol/L的上下游引物各2 μL,無(wú)核酸酶超純水補(bǔ)齊到50 μL。93℃預(yù)變性3 min,變性、退火、延伸各1 min,35個(gè)循環(huán),72℃補(bǔ)齊2 min。應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)目的基因表達(dá)。

        表1 引物序列

        1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用 SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用 t檢驗(yàn),若不符合正態(tài)分布則用Wilcoxon秩和檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 2組細(xì)胞增殖能力檢測(cè)比較

        表2顯示,與同血清含量的對(duì)照組比較,5%濃度含藥血清對(duì)細(xì)胞的增殖起到抑制作用,1.25%和2.5%濃度的組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明較低濃度的藥物對(duì)細(xì)胞增殖不起作用。

        2.2 2組細(xì)胞遷移能力比較

        表2顯示,與同血清含量的對(duì)照組比較,1.25%、2.5%、5%濃度的含藥血清皆能顯著提高內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力(P<0.01)。

        2.3 2組細(xì)胞黏附能力比較

        表 2顯示,與同血清含量的對(duì)照組比較,1.25%、2.5%、5%濃度的含藥血清皆能顯著提高內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力(P<0.01)。

        表2 不同濃度含藥血清對(duì)HUVEC-12細(xì)胞的增殖、遷移、黏附能力影響(±s)

        表2 不同濃度含藥血清對(duì)HUVEC-12細(xì)胞的增殖、遷移、黏附能力影響(±s)

        注:與同血清含量對(duì)照組比較:*P<0.05,**P<0.01

        組別 例數(shù) 血清含量 增殖 遷移 黏附含藥血清空白血清39.0±1.1**51.9±2.5**40.6±5.2**11.9±1.0 21.5±2.0 27.0±1.9 10 10 10 10 10 10 1.25% 2.5% 5.0% 1.25% 2.5% 5.0% 0.086±0.016 0.111±0.027 0.085±0.024*0.099±0.028 0.100±0.012 0.092±0.010 24.0±5.5**34.3±1.3**36.0±0.8**14.2±0.4 7.6±1.1 13.0±1.2

        2.4 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

        表3顯示,藥物血清可以抑制 EphrinB2和EphB42個(gè)基因的表達(dá),但具體情況稍有不同。與同血清含量的對(duì)照組比較,只有1.25%,2.5%2個(gè)較低濃度含藥血清抑制 EphrinB2的表達(dá),而對(duì)于EphB4,3個(gè)濃度含藥血清皆抑制其表達(dá)。

        3 討論

        血管新生是指在原有毛細(xì)血管網(wǎng)基礎(chǔ)上,通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、黏附和分化形成新的毛細(xì)血管網(wǎng)的過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,血府逐瘀湯1.25%、2.5%、5%3個(gè)濃度含藥血清對(duì)HUVEC-12的遷移、黏附都有顯著的促進(jìn)作用,與課題組前期其他細(xì)胞株的研究結(jié)果一致[1],說(shuō)明藥物從細(xì)胞水平通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞遷移和黏附發(fā)揮促血管生長(zhǎng)作用。有學(xué)者[6]認(rèn)為,血府逐瘀湯含藥血清可抑制牛內(nèi)皮細(xì)胞遷移,并與濃度呈正相關(guān),其所用的含藥血清濃度為10%以上。本實(shí)驗(yàn)中高濃度5%含藥血清抑制了細(xì)胞的增殖,與上述學(xué)者更高濃度的藥物血清作用一致,提示藥物促血管生長(zhǎng)的局限性。本課題組前期在體實(shí)驗(yàn)[4,7]顯示,血府逐瘀湯在缺血損傷早期有效促進(jìn)肉芽組織血管新生的作用隨肉芽組織的纖維化而消失,出現(xiàn)短暫促血管生長(zhǎng)的特點(diǎn)。檢測(cè)不同濃度藥物血清對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ECV304增殖、遷移和體外成血管的影響提示存在濃度限定范圍[8]。在體和離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致體現(xiàn)血府逐瘀湯促血管新生作用限制于某個(gè)較適宜的濃度和作用時(shí)間點(diǎn)[1,5],體現(xiàn)了藥物對(duì)血管生長(zhǎng)的獨(dú)特調(diào)控性。

        表3 藥物對(duì)HUVEC-12細(xì)胞目的基因表達(dá)的影響結(jié)果(±s)

        表3 藥物對(duì)HUVEC-12細(xì)胞目的基因表達(dá)的影響結(jié)果(±s)

        注:與同血清含量對(duì)照組比較:*P<0.05,**P<0.01

        組 別 例數(shù) 血清含量 EphB4灰度值 ephrinB2灰度值含藥血清空白血清0.44±0.12*0.27±0.08**0.34±0.11 0.70±0.15 0.64±0.04 0.49±0.09 4 4 4 4 4 4 1.25% 2.5% 5.0% 1.25% 2.5% 5.0% 0.25±0.04**0.70±0.02*0.15±0.04**0.85±0.02 0.77±0.05 0.33±0.04

        EphB4與 EphrinB2是酪氨酸蛋白激酶受體家族成員,二者互為配、受體。前期大量實(shí)驗(yàn)集中于EphB4/EphrinB2在胚胎發(fā)育期與動(dòng)靜脈分化的關(guān)系,隨后發(fā)現(xiàn)其影響細(xì)胞遷移等功能,在調(diào)控血管新生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。如有研究[9]表明,顯微注射信號(hào)EphrinB2可以不依賴于受體EphB4的結(jié)合直接增加 HUVECs細(xì)胞的遷移速度,提示該信號(hào)本身就可獨(dú)立發(fā)揮作用,但更多實(shí)驗(yàn)關(guān)注通路對(duì)血管新生的影響。該通路并不局限于信號(hào) EphrinB2與受體EphB4的正向傳導(dǎo),還可通過(guò)細(xì)胞間的接觸形成EphB4作為信號(hào)。EphrinB2作為受體的獨(dú)特反向信號(hào)傳遞,由于雙向信號(hào)的復(fù)雜性和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的差異性,除少數(shù)研究得出相反的結(jié)論[10-11]外,目前多數(shù)研究認(rèn)為正向信號(hào)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、黏附和血管新生,反向信號(hào)促進(jìn)上述過(guò)程進(jìn)而促血管新生[12-13]。本實(shí)驗(yàn)中藥物對(duì) HUVEC-12的遷移、黏附都有顯著的促進(jìn)作用,同時(shí) EphB4和EphrinB2基因皆下調(diào)表達(dá),說(shuō)明藥物促血管新生的作用機(jī)制確實(shí)與 EphB4/EphrinB2通路密切相關(guān)。究竟藥物調(diào)控血管生長(zhǎng)主要通過(guò)影響正向還是反向抑或雙向信號(hào)均發(fā)生反應(yīng),尚需進(jìn)一步的開展EphB4和EphrinB2蛋白磷酸化改變的研究才能得到明確結(jié)論。

        EphB4/EphrinB2影響血管生長(zhǎng)的研究已持續(xù)10余年,鑒于其重要作用,有學(xué)者推測(cè) EphB4/ EphrinB2通路有望成為又一抗血管生成的靶向目標(biāo)。采用特定的 EphrinB2抗體代替或與現(xiàn)有的抗血管生成藥聯(lián)用,有可能為血管相關(guān)性疾病提供有效的治療策略[12]。由于其雙向通路的復(fù)雜性為明確機(jī)制設(shè)置了障礙,通過(guò)本項(xiàng)目研究有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)EphB4/EphrinB2信號(hào)通路對(duì)血管新生的調(diào)控作用,并為血府逐瘀湯的臨床應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        [1]高冬,陳文元,吳立婭,等.血府逐瘀湯誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞促血管新生的基因調(diào)控研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,30 (2):153-156.

        [2]高冬,吳立婭,焦雨歡,等.血府逐瘀湯動(dòng)員骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的因素分析[J].中醫(yī)雜志,2010,51(5):457-459.

        [3]Gao D,WuLY,JiaoYH,etal.TheEffectofXuefuZhuyu Decoctionon in vitro endothelial progenitor cell tube formation[J].Chin J Integr Med,2010,16(1):50-53.

        [4]高冬,焦雨歡,武一曼,等.血府逐瘀湯誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞參與缺血區(qū)血管新生的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2012,32(2):239-243.

        [5]Song J,Chen WY,Gao D,et al.A microarray analysis of angiogenes is modulation effect of XuefuZhuyu decoctionon endothelial cells[J].Chin J Integr Med,2012,18(7):1-5.

        [6]丁志山,高承賢,程?hào)|慶,等.血府逐瘀湯對(duì)牛內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響[J].中成藥,2003,25(5):423-424.

        [7]施偉麗,蘇曉艷,莊淑美,等.血府逐瘀湯對(duì)大鼠后肢缺血模型血管新生的影響[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2014,4: 465-467.

        [8]高冬,陳文元,吳立婭,等.血府逐瘀湯誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞血管新生中一氧化氮的作用[J].中醫(yī)雜志,2011,52(21):1852-1855.

        [9]Magdalena L.Bochenek,Sarah Dickinson,Jonathan W.Astin,et al.EphrinB2 regulates endothelial cell morphology and motility independently of Eph-receptor binding[J].Journal of Cell Science,2010,123(8):1235-1246.

        [10]Zhang XQ,Takakura N,Oike Y,et al.Stromal cells expressing ephrin-B2 promote the growth and sprouting of ephrin-B2(+) endothelial cells[J].Blood,2001,98(4):1028-1037.

        [11]Maekawa H,OikeY,KandaS,etal.EphrinB2induces migration of endothelial cells through the phosphatidylino-3 kinase pathway and promotes angiogenesis in adult vasculature[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2003,23(11):2008-2014.

        [12]Adams RH,Diella F,Hennig S,et al.The cytoplasmic domain of the ligand EphrinB2 is required for vascular morphogenesis but not cranial neural crest migration[J].Cell,2001,104(1):57-69.

        [13]Hamada K,Oike Y,Ito Y,et al.Distinct roles of ephrin-B2 forward and EphB4 reverse signaling in endothelial cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2003,23(2):190-197.

        Roles of EphB4/ephrinB2 in Angiogenesis induced by Xuefu Zhuyu Decoction

        XU Xiao-ling1,CAI Fei1,LIN Fang1,WANG Yi-zheng1,GAO Dong1△,SONG Jun2
        (1.Department of integrative Medicine,F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine,F(xiàn)uzhou 350108,China; 2.Experimental Reserch Center,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China.)

        object To explore the roles of EphB4/ephrinB2 in Angiogenesis induced by Xuefu Zhuyu Decoction (XZD).Methods:Using serum pharmacology technique to study the cell proliferation,migration,adhesion,ephrinB2 and EphB4 gene expression by MTT,Boyden chamber,cell adhesion and reverse transcriptase polymerase chain reaction(RTPCR)separately on Human Umbilical Vein Endothelial Cells(HUVEC-12)after intervened by 1.25%,2.5%and 5% XZD containing serums for 48h.ResultsComparison with the control group of same serum level,5%medicated serum inhibited cell proliferation.1.25%,2.5% and 5% medicated serum had significant effect on promoting endothelial cell migration or adhesion and inhibition the EphB4 expression.1.25% and 2.5% medicated serum inhibited EphrinB2 expression.ConclusionXZD had significant effect on cell migration and adhesion to promote angiogenesis which is closely related to the EphB4/EphrinB2.

        Xuefu Zhuyu Decoction;EphB4/ephrinB2;angiogenesis

        R285.5

        :B

        :1006-3250(2016)03-0362-03

        2015-08-22

        國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(O.81173431)

        許曉玲(1987-),女,漳州人,醫(yī)學(xué)碩士,從事活血化瘀藥物應(yīng)用的基礎(chǔ)研究。

        △通訊作者:高 冬,Tel:0591-22861151,E-mail:gd1026@ yahoo.com.cn。

        猜你喜歡
        含藥血府逐瘀湯內(nèi)皮細(xì)胞
        急救含藥姿勢(shì)要正確
        淺議角膜內(nèi)皮細(xì)胞檢查
        Effect of Xuebijing injection on hematopoietic homeostasis of LPS induced sepsis in mice
        乳病消片含藥血清對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用
        中成藥(2018年10期)2018-10-26 03:40:44
        雌激素治療保護(hù)去卵巢對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的初步機(jī)制
        細(xì)胞微泡miRNA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控
        痰瘀與血管內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)系研究
        冠心II號(hào)含藥血清對(duì)心肌缺血再灌注樣損傷的保護(hù)作用
        血府逐瘀湯治療隱匿性抑郁癥療效觀察
        加味血府逐瘀湯聯(lián)合西藥治療失眠癥臨床觀察
        免费精品美女久久久久久久久久| 一本色道久久88亚洲精品综合 | 狠狠躁夜夜躁人人躁婷婷视频| 精品一区二区三区无码视频| 国产亚洲精品日韩香蕉网| 国产三级国产精品国产专播| 欧洲多毛裸体xxxxx| 伊人色综合九久久天天蜜桃| 国产成人精品cao在线| 男人的精品天堂一区二区在线观看| 国产成人av在线免播放观看新| 日日躁夜夜躁狠狠躁超碰97| 欧美日一本| 中文av字幕一区二区三区| 国产肉体xxxx裸体137大胆| 亚欧AV无码乱码在线观看性色 | 日韩女同视频在线网站| 中文字幕一区在线观看视频| 囯产精品无码一区二区三区| 日本女优爱爱中文字幕| 邻居少妇张开腿让我爽了一夜| 不卡高清av手机在线观看| 国产尤物二区三区在线观看| 国产91极品身材白皙| 亚洲精品www久久久久久 | 国产成人一区二区三区视频免费蜜 | 亚洲无码观看a| 中文字幕av永久免费在线| 亚洲国产精品无码专区影院| 国产精品亚洲А∨天堂免下载| 精品国产污黄网站在线观看| 国产精品美女一区二区视频| 中文字幕无码家庭乱欲| 日本一区二区三区啪啪| 亚洲最大中文字幕在线| 无码国产精品一区二区免费模式| 亚洲V无码一区二区三区四区观看| 日本精品中文字幕人妻| 色欲aⅴ亚洲情无码av| 亚洲中文无码久久精品1| 国产盗摄一区二区三区av|