孫丹丹，王春紅，尹建元，陳凡波，李亨，孟勤

(吉林大學(xué)?a．藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室；?b．藥學(xué)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，長(zhǎng)春?130021)

知母(Rhizoma Anemarrhenae)來(lái)源于百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的根莖，具有清熱瀉火、滋陰潤(rùn)燥的功效，用于外感熱病、高熱煩渴、肺熱燥咳、骨蒸潮熱、內(nèi)熱消渴、腸燥便秘等癥[1]?，F(xiàn)代研究表明，知母中的化學(xué)成分主要為甾體皂苷、雙苯吡酮類、木脂素類、多糖類等[2，3]，其中知母皂苷BⅡ?yàn)檫荤拊碥?，是知母藥材中的主要有效成分[4]。本實(shí)驗(yàn)考察了知母皂苷BⅡ的薄層色譜條件，為知母質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供一定依據(jù)。因知母皂苷BⅡ結(jié)構(gòu)中無(wú)共軛系統(tǒng)[4]，沒(méi)有紫外吸收，故采用靈敏度較高的蒸發(fā)光散射器對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，建立了測(cè)定知母中知母皂苷BⅡ含量的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)(HPLC-ELSD)方法[5～8]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Alltech 2000型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)奧泰公司)；Series Ⅲ雙泵高效液相色譜儀(美國(guó)SSI公司)；薄層板(青島海洋化工廠分廠)；BT125D電子天平(0.01mg，德國(guó)賽得利斯公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑

不同來(lái)源知母藥材(吉林省仙草藥材有限公司)。知母皂苷BⅡ?qū)φ掌?上海融禾生物科技公司，批號(hào)：121011)。乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層檢測(cè)

取本品200mg，加30%丙酮1mL充分溶解，作為樣品溶液；取知母皂苷BⅡ標(biāo)準(zhǔn)品200mg，加30%丙酮1mL充分溶解，作為對(duì)照品溶液；按薄層色譜法(中國(guó)藥典2010版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述樣品和對(duì)照品各2μL，依次點(diǎn)于同一塊十八烷基硅烷鍵合硅膠薄層板上，以氯仿-甲醇-水(6∶4∶0.5)為展開劑，展開后，取出，晾干后噴以10%硫酸-乙醇溶液，在105℃下烘10min，取出，檢視(圖1)。

結(jié)果：樣品和對(duì)照品展開良好，對(duì)照品知母皂苷BⅡ顯色非常明顯，樣品與其在色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.2 知母皂苷BⅡ的含量測(cè)定

2.2.1對(duì)照品溶液的制備取知母皂苷BⅡ?qū)φ掌愤m量，精密稱定，加30%丙酮制成0.50mg/mL的溶液，即得。

圖1 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的薄層色譜圖

Fig.1TLCchromatogramsofsampleandreferencesubstancesolution

2.2.2供試品溶液的制備取樣品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約0.15g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30% 丙酮25mL，稱定重量，超聲處理(功率400W，頻率40kHz)30min，取出，放冷，再稱定重量，用30% 丙酮補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液。

2.2.3色譜條件色譜柱為Alltima C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈-水(25∶75)，流速1.0mL/min，ELSD檢測(cè)器漂移管溫度為100℃，載氣流速為3.0mL/min，柱溫為室溫25℃。按以上色譜條件得到對(duì)照品及樣品色譜圖，見圖2、圖3。

圖2 對(duì)照品色譜圖

圖3 樣品色圖譜

2.2.4線性關(guān)系試驗(yàn)精密稱取知母皂苷BⅡ?qū)φ掌?.98mg，置25mL容量瓶中，加30%丙酮溶液使其溶解并稀釋至刻度，搖勻即得濃度為0.4mg/mL對(duì)照品溶液。按照上述色譜條件依次進(jìn)樣5μL、10μL、20μL、50μL、100μL、200μL，測(cè)定其峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=1871.4X+4649.1，r=0.9996。結(jié)果表明，知母皂苷BⅡ?qū)φ掌吩?.0μg～80.0μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5精密度試驗(yàn)分別取知母皂苷BⅡ?qū)φ掌啡芤?，按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μL，測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD為1.2%，表明精密度良好。

2.2.6重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次的知母藥材，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，取10μL 進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果知母皂苷BⅡ峰面積的RSD為1.8%，表明方法重復(fù)性較好。

2.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液，按照上述色譜條件分別在1h、5h、10h、15h進(jìn)樣10μL進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果知母皂苷BⅡ的RSD為0.6%，表明供試品溶液在15h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.2.8回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量的樣品0.5g，置具塞錐形瓶?jī)?nèi)，分別加入相當(dāng)于各被測(cè)物含量的80%、100%、120%的對(duì)照品儲(chǔ)備液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備低、中、高回收率樣品各3份。測(cè)定知母皂苷BⅡ平均回收率分別為99.5%，RSD為1.89%。

2.2.9不同產(chǎn)地樣品含量測(cè)定分別稱取8個(gè)不同產(chǎn)地的樣品，按“2.2”項(xiàng)供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，依上述色譜條件分別進(jìn)樣10μL，計(jì)算知母皂苷BⅡ的含量，結(jié)果見表1。

表1樣品含量測(cè)定結(jié)果

Table 1The content of samples (n=2)

3 討論

3.1 展開劑的改進(jìn)

本實(shí)驗(yàn)除采用HPLC-ELSD方法對(duì)知母中的知母皂苷BⅡ定性定量的測(cè)定外，還進(jìn)行了樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的薄層色譜對(duì)照，本實(shí)驗(yàn)考察了多種展開劑如：乙腈-水(1∶1)、正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)、氯仿-甲醇-水(7∶3∶1)，結(jié)果顯示均不理想，在多次反復(fù)的實(shí)驗(yàn)中以氯仿-甲醇-水(6∶4∶0.5)為展開劑效果最為理想。此方法不僅完成了樣品定性實(shí)驗(yàn)，而且對(duì)知母皂苷BⅡ柱層析分離方法提供了可靠的參考。

3.2 不同產(chǎn)地致含量差異

知母分布比較廣泛，在我國(guó)主要分布于河北省、山西省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、遼寧省、黑龍江省、吉林省等地區(qū)[9]。因此，實(shí)驗(yàn)分別對(duì)8個(gè)不同產(chǎn)地的知母中知母皂苷BⅡ的含量進(jìn)行了測(cè)定，由測(cè)定結(jié)果可見，不同地區(qū)知母所含知母皂苷BⅡ含量存在較明顯差異。其中，河北易縣、內(nèi)蒙古赤峰樣品中知母皂苷BⅡ含量較高。為了保證知母的用藥質(zhì)量，應(yīng)考察不同產(chǎn)地的生長(zhǎng)條件，盡量減小知母藥材的質(zhì)量差異或者在知母質(zhì)量好的產(chǎn)地建立知母生產(chǎn)基地。

3.3 實(shí)驗(yàn)溶劑的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-ELSD法測(cè)定知母中知母皂苷BⅡ的含量，選擇丙酮作為溶劑，因?yàn)橐译鎸儆谥械榷拘缘娜軇?，毒性?qiáng)于丙酮，且乙腈是易燃化學(xué)制劑，因此，丙酮便被選為本實(shí)驗(yàn)的溶劑，分別測(cè)定了30%、40%、50% 3種不同濃度的丙酮作為溶劑的知母皂苷BⅡ含量，結(jié)果顯示，30%的丙酮為最適溶劑濃度，可用于知母皂苷BⅡ的質(zhì)量控制與分析。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典2010年版:一部[K].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:2197-2198.

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