盧姍姍，徐東平，李 進(jìn)

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HBV前S/S基因突變的研究進(jìn)展

盧姍姍，徐東平，李 進(jìn)

[摘要]HBV前S/S區(qū)基因突變可以是自發(fā)的，也可以是外界壓力選擇的結(jié)果。突變株可通過輸血、器官移植、分娩等造成HBV感染，也可以引起急性、慢性和隱匿性HBV感染。HBV前S/S基因突變可導(dǎo)致病毒生物學(xué)特點(diǎn)和免疫應(yīng)答發(fā)生改變，引起免疫逃逸、疫苗預(yù)防失敗、HBsAg陰性感染和疾病重癥化等，與肝硬化和肝癌的進(jìn)展也有密切關(guān)系，從而影響HBV慢性感染的臨床轉(zhuǎn)歸。

[關(guān)鍵詞]乙型肝炎病毒；基因型；突變；疾病惡化

[作者單位] 541004 ，桂林醫(yī)學(xué)院研究生院（盧姍姍）；100039 北京，解放軍第三〇二醫(yī)院臨床研究管理中心（徐東平），醫(yī)務(wù)部（李進(jìn)）

自從1992年乙型肝炎（乙肝）疫苗的廣泛接種以及多種抗病毒藥物的使用，雖然使HBV感染率呈現(xiàn)下降趨勢，但在世界范圍內(nèi)HBV感染仍然是一個重要的公共健康問題。中國作為HBV感染率較高的國家，這一問題尤為嚴(yán)重。HBV慢性感染可以引起不同的臨床表現(xiàn)，包括無癥狀攜帶（免疫耐受期）、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化（liver cirrhosis, LC）、肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）以及隱匿性HBV感染（occult HBV infection, OBI）。臨床上血清中HBsAg和HBsAb同時陽性的患者并不少見，另有少數(shù)HBsAg陰性、HBsAb陽性的患者血清中也能檢測到HBV DNA的存在，甚至在免疫預(yù)防的人群中也出現(xiàn)了HBV感染，包括接受乙肝疫苗者、HBsAg陰性肝移植受者和免疫球蛋白阻斷母嬰傳播的嬰兒。研究表明 HBV前S/S基因突變是引起上述現(xiàn)象的主要機(jī)制之一，尤其是當(dāng)突變發(fā)生在HBV S基因的主要親水區(qū)域（major hydrophilic region，MHR；aa 99-169）內(nèi)時可引起抗原性的明顯改變，還發(fā)現(xiàn)前S/S基因突變與肝臟疾病進(jìn)展為LC和HCC也有相關(guān)性[1]。我們就近年來在此方面的研究進(jìn)展，結(jié)合本課題組的工作，對HBV前S/S基因的結(jié)構(gòu)和功能、基因突變特點(diǎn)、突變的臨床意義以及相關(guān)應(yīng)對措施綜述如下。

1　前S/S基因的結(jié)構(gòu)及功能

HBV基因組含有4個開放讀碼框區(qū)：前S/S區(qū)、前C/C區(qū)、P區(qū)和X區(qū)。其中前S/S基因主要包括前S1區(qū)基因、前S2區(qū)基因和S區(qū)基因，在起始端均有各自的起始密碼子，但共用同一個終止密碼子。前S/S基因主要編碼3種不同的、結(jié)構(gòu)相關(guān)的包膜蛋白：大、中、小蛋白。S區(qū)包含226個氨基酸，編碼小蛋白即HBsAg，是病毒包膜蛋白的主要抗原區(qū)域，是中和抗體的主要識別位點(diǎn)，此區(qū)域發(fā)生變異，病毒的抗原性和免疫原性將可能發(fā)生顯著改變。前S2區(qū)由55個氨基酸組成，前S1區(qū)因基因亞型的不同而造成長度不固定，由108或119個氨基酸構(gòu)成，此區(qū)域包含與肝細(xì)胞結(jié)合受體牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽的結(jié)構(gòu)域[2]，在病毒感染進(jìn)入細(xì)胞中起重要作用。前S/S基因除了編碼包膜蛋白與病毒基因形成病毒顆粒外，還形成大量不含病毒核酸亞顆粒釋放到血清中。此外，S基因與P基因的反轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase, RT）區(qū)重疊，因此抗病毒藥物治療導(dǎo)致某些RT基因耐藥突變會引起S區(qū)基因?qū)?yīng)位點(diǎn)的錯義或無義突變。

2　前S/S區(qū)基因突變特點(diǎn)

HBV在復(fù)制過程中需要的DNA聚合酶缺乏校正功能，導(dǎo)致HBV出現(xiàn)高突變率，在宿主壓力、疫苗和免疫球蛋白預(yù)防以及抗病毒藥物的外界壓力下對環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)的HBV突變株將選擇性地成為優(yōu)勢株。HBV突變可改變蛋白的構(gòu)象及功能，進(jìn)而影響HBV感染的臨床表現(xiàn)特點(diǎn)。研究顯示改變了病毒生物特點(diǎn)的突變株與病毒性肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系[1,3]。HBV突變并不是平均分布在整個基因組中，在某個特定的區(qū)域內(nèi)更加常見，如BCP區(qū)/前C區(qū)和前S/S區(qū)[4]。由于前S/S蛋白具有強(qiáng)免疫原性，因此在機(jī)體的免疫壓力下前S/S基因容易發(fā)生突變。關(guān)于前S區(qū)突變的報道大多與T細(xì)胞、B細(xì)胞表位的缺失有關(guān)，前S大片段缺失突變還可引起HBsAg表達(dá)或分泌水平的顯著降低，因此可能會造成HBV發(fā)生免疫逃逸[5]。針對HBsAb出現(xiàn)的免疫逃逸突變主要位于S區(qū)的MHR，尤其是“a”決定簇（aa 124-147）內(nèi)，該區(qū)域發(fā)生突變可能會導(dǎo)致HBsAg構(gòu)象發(fā)生改變并影響其抗原性和免疫原性，引起免疫逃逸，如最經(jīng)典的G145R突變[6]。有研究表明在HBsAg和HBsAb同時陽性的患者樣本中，前S區(qū)基因缺失突變伴隨S區(qū)基因點(diǎn)突變的檢出率較高，可引起較強(qiáng)的免疫逃逸，推測是免疫壓力選擇的結(jié)果[7]。

3　前S/S基因突變的意義

3.1與LC和HCC發(fā)生的關(guān)系 眾多研究顯示HBV前S/S基因突變與HCC的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系[8-10]。我們課題組近期通過大量臨床樣本篩查也發(fā)現(xiàn)，在HBV感染的疾病進(jìn)程中，前S缺失突變的檢出率呈現(xiàn)一個明顯遞增的趨勢，在LC階段前S1缺失突變顯著增多，而前S2缺失突變在HCC中明顯升高，因此我們推測前S基因缺失突變可能促進(jìn)了肝臟疾病的進(jìn)展[11]。相關(guān)數(shù)據(jù)也顯示了前S突變在HCC發(fā)病機(jī)制中潛在的作用[12-14]。普遍認(rèn)為前S基因突變可以使包膜蛋白比例失調(diào)，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中生產(chǎn)過剩和堆積，增加了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起細(xì)胞內(nèi)活性氧族增加，造成DNA氧化損傷和基因的不穩(wěn)定性，促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展[13,15]。同時，堆積了突變蛋白的毛玻璃樣肝細(xì)胞也被認(rèn)為是HCC的前期病變的基礎(chǔ)[12]。此外，前S2蛋白可直接作用于Jun活化結(jié)構(gòu)域-連接蛋白1，導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p27降解和細(xì)胞周期發(fā)生變化[16]，也可通過細(xì)胞周期蛋白A和環(huán)氧合酶-2的過表達(dá)，從而影響細(xì)胞周期的進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖和貼壁不依賴性生長，進(jìn)而促進(jìn)LC和HCC的發(fā)生[17]。此外，前S基因缺失和起始密碼子突變也可通過降低S抗原水平，影響機(jī)體免疫清除導(dǎo)致病程隱匿發(fā)展，增加了LC 和HCC的發(fā)生風(fēng)險。

在宿主和抗病毒治療壓力下，S區(qū)基因某種特殊的突變也可潛在影響HCC的進(jìn)展。研究顯示在產(chǎn)生拉米夫定耐藥的患者中HCC的發(fā)生率要高于未使用核苷類藥物的人群[18]。長期使用拉米夫定抗病毒治療容易發(fā)生藥物選擇壓力導(dǎo)致的耐藥突變，其中RT區(qū)A181T突變可同時引起S基因的W172位點(diǎn)提前終止，導(dǎo)致表面蛋白C末端疏水區(qū)域缺失55個氨基酸，出現(xiàn)S截斷蛋白，影響病毒分泌并激活癌基因啟動子，隨訪觀察到A181T/ sW172*突變患者較未突變患者HCC發(fā)生率顯著增高，從而提示該突變對HCC的發(fā)展有一定促進(jìn)影響[19-20]。核苷類藥物抑制病毒復(fù)制但并不直接作用于S基因轉(zhuǎn)錄和S蛋白分泌，HBV的致癌性可能與表面蛋白在細(xì)胞內(nèi)堆積引起的氧化應(yīng)激有關(guān)，而突變的S蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中生產(chǎn)過剩和滯留，增加了HCC的發(fā)生風(fēng)險[3]。

3.2與OBI發(fā)生的關(guān)系 血清中HBsAg陽性是診斷HBV感染的基本指標(biāo)，但是在少數(shù)HBsAg陰性的患者血清中或肝組織中也能檢測到HBV DNA，這種狀態(tài)被稱為OBI[21]。OBI的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但是值得重視的是部分OBI是由于HBV前S/S基因發(fā)生了針對HBsAb產(chǎn)生的免疫逃逸突變引起的。我們課題組近期對多例比較特殊的OBI患者進(jìn)行了動態(tài)跟蹤，發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)存在多種HBV 前S/S突變株，其中在1例患者中發(fā)現(xiàn)多種新的突變或聯(lián)合突變，包括前S1基因片段缺失突變、前S2起始密碼子突變、S基因MHR的點(diǎn)突變和插入突變。在HBV突變中，包括a決定簇點(diǎn)突變和新增N-糖基化位點(diǎn)突變等，證實(shí)前S1基因大片段缺失顯著降低HBsAg表達(dá)水平，S基因MHR區(qū)的某些突變可顯著降低HBsAg的抗原性，提示前S/S基因突變是患者發(fā)生OBI的原因[22]。我們發(fā)現(xiàn)，攜帶某些S基因突變的OBI患者常有低水平HBsAb，提示這些突變可能誘導(dǎo)產(chǎn)生低水平的抗體干擾了試劑檢測。我們在陜西省寶雞市血液中心獲得60份疑似OBI血清樣本，采用巢式PCR擴(kuò)增其前S/S區(qū)基因后發(fā)現(xiàn)大部分序列均存在不同形式不同位點(diǎn)突變。Kim等[23]認(rèn)為S區(qū)基因突變，尤其是MHR區(qū)內(nèi)的突變，不僅影響S蛋白的抗原性，而且影響病毒和S蛋白的分泌，引起OBI的發(fā)生。HBsAg是HBsAb主要的識別位點(diǎn)，也是疫苗的作用靶點(diǎn)，此區(qū)域基因發(fā)生變化，可以降低HBsAg的抗原性，甚至導(dǎo)致商業(yè)性的HBsAg檢測試劑對突變株HBsAg無法識別，引起HBsAg出現(xiàn)陰性結(jié)果。Yu等[24]發(fā)現(xiàn)在HBsAg和抗HBsAg雙陽性的患者中，S基因MHR區(qū)新增N-糖基化位點(diǎn)突變檢出率顯著增高，此類突變可顯著降低HBsAg的抗原性，干擾HBsAb的識別，并增加病毒分泌能力。另有研究報道前S缺失突變可通過影響HBV的基因型和HBsAg表達(dá)導(dǎo)致OBI的發(fā)生[25]。

3.3引起臨床免疫預(yù)防失敗 一般來說，接種乙肝疫苗后誘導(dǎo)產(chǎn)生的HBsAb可以識別和清除HBV，預(yù)防HBV的感染。理論上，HBsAg與HBsAb通常處于動態(tài)平衡中，即HBsAb在HBsAg轉(zhuǎn)陰后幾周，經(jīng)過一段時間才會在血清中被檢測到，也就是說兩者通常不應(yīng)在血清中同時出現(xiàn)。但在臨床實(shí)踐中，一些慢性HBV感染者血清中可檢測到HBsAg和HBsAb同時陽性，且近年來隨著檢測方法靈敏度的提高，這種現(xiàn)象明顯增多[26]。有研究表明這種現(xiàn)象有的與HBsAg發(fā)生免疫逃逸突變相關(guān)，因突變HBsAg可顯著影響HBsAb的結(jié)合[24]。有研究表明HBV感染者接受肝移植后出現(xiàn)S基因突變病毒可導(dǎo)致移植失敗[27]，在母嬰傳播阻斷失敗的嬰兒體內(nèi)也檢測到了并非來自母親的攜有S基因突變的病毒株[28]。最近我國浙江大學(xué)學(xué)者在1例乙肝疫苗阻斷母嬰傳播失敗的3歲OBI患者樣本中檢出了一種sP120Q＋sD144A新型聯(lián)合免疫逃逸突變毒株[29]。Yu等[24]發(fā)現(xiàn)攜有S基因新增N-糖基化突變的病毒株也可以感染乙肝疫苗接種者。因此，S基因發(fā)生突變可賦予HBV逃逸抗體結(jié)合的特性，引起乙肝疫苗預(yù)防失效、高效價免疫球蛋白失去保護(hù)效用，因而S基因突變HBV具有在乙肝疫苗接種人群中傳播及其引起特異性高效價免疫球蛋白阻斷HBV感染失效的潛在風(fēng)險。

3.4對臨床免疫檢測的影響 對HBsAg的檢測主要依靠以抗原-抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫方法，HBV前S/S基因突變引起HBsAg識別表位構(gòu)象發(fā)生改變通常會引起不一樣的檢測結(jié)果。試劑不同，用同一種方法對同一標(biāo)本進(jìn)行檢測，其結(jié)果也可能會不完全一致。有研究報道用同一種檢測方法、7種不同的試劑盒對13種突變株分別進(jìn)行檢測，其結(jié)果并不是完全一致，表明前S/S區(qū)基因突變也會影響檢測試劑的靈敏度和特異性[30]。HBV前S/S基因發(fā)生突變會影響HBsAg突變株的檢測靈敏度下降，甚至還可能完全檢測不到，造成臨床上的漏診、誤診。

4　應(yīng)對HBV前S/S基因突變的相關(guān)措施

HBV前S/S基因的高突變率、低檢出率、極易發(fā)生免疫逃逸、導(dǎo)致免疫預(yù)防失敗、影響肝臟疾病進(jìn)程等一系列問題，均給臨床對HBV感染的預(yù)防、診斷、治療和預(yù)后帶來了挑戰(zhàn)。前S/S基因變異有可能導(dǎo)致突變病毒在乙肝疫苗接種人群中傳播的公共危害，須要引起我們的關(guān)注。

在檢測技術(shù)上，使用靈敏度高、檢測抗原性廣的HBsAg檢測試劑。對現(xiàn)有試劑識別差的新型突變，應(yīng)考慮改進(jìn)試劑，篩選加入可以識別突變抗原的抗體。在篩選獻(xiàn)血員時，應(yīng)同時檢測HBV DNA。在研究中，采用巢式PCR技術(shù)對核酸序列的檢測不失為一個高靈敏度、高特異性、高精確的檢測方法，對HBV DNA載量低于檢測下限的部分樣本也能擴(kuò)增出HBV目標(biāo)基因序列。在疫苗技術(shù)上，利用基因重組技術(shù)合成帶有前S區(qū)基因的疫苗，同時也應(yīng)對現(xiàn)有疫苗誘導(dǎo)的抗體是否可以有效保護(hù)突變病毒的感染做出評估。在致病機(jī)制上，進(jìn)一步深入研究前S/S基因與疾病進(jìn)展的關(guān)系，包括擴(kuò)大研究樣本量，進(jìn)行長期隨訪研究，闡明相關(guān)分子機(jī)制，獲得前S/S基因突變株引起LC和HCC的直接實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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（2015-10-29 收稿 2015-12-01 修回）

（責(zé)任編委 王永怡 本文編輯 盧福昱）

Research progress of HBV preS/S gene mutations

LU Shan-shan, XU Dong-ping, LI Jin*
Graduate School of Guilin Medical College, Guilin, Guangxi Zhuang Autonomous Region 541004, China
*Corresponding author, E-mail: lijin302@hotmail.com

[Abstract]HBV preS/S gene mutations may occur spontaneously or may be the consequence of selection by outside pressures. The viral mutants may induce HBV infection through blood transfusion, organ transplantation and mother-to-children transmission, or cause acute, chronic and occult HBV infection. The HBV preS/S gene mutations may lead to the change of biological characteristics of the virus and the immune responses, causing immune escape, immunoprophylaxis failure, HBsAg-negative HBV infection and the aggravation of the disease. It suggests that the mutations are associated with the development of liver fibrosis and hepatocellular carcinoma, therefore affecting clinical outcome of chronic HBV infection.

[Key words]hepatitis B virus; gene type; mutation; disease progression

[通訊作者]李進(jìn)，E-mail: lijin302@hotmail.com

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81373136、81271847）

DOI:10.3969/j.issn.1007-8134.2016.02.013

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中國圖書資料分類號] R373.21；R-058；R394.112 A

[文章編號]1007-8134(2016)02-0112-05