張　松，李震宇，秦雪梅

(1.山西省分析科學研究院　核磁共振檢測研究室，山西　太原　030006；2.山西大學

中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西　太原　030006)

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不同批次SD大鼠血清的代謝組學比較

張松1，李震宇2*，秦雪梅2*

(1.山西省分析科學研究院核磁共振檢測研究室，山西太原030006；2.山西大學

中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西太原030006)

摘要：基于核磁共振氫譜(1H NMR)的代謝組學及多元統(tǒng)計等技術(shù)分析不同飼養(yǎng)時期的健康SD大鼠血清，探討了不同批次的實驗動物在機體代謝上的差異性。結(jié)果表明不同批次的SD大鼠血清代謝物中，檸檬酸、丙酮酸、琥珀酸、谷氨酰胺、二甲基甘氨酸等成分的含量相對穩(wěn)定，而丙氨酸、精氨酸、異亮氨酸、乳酸、3-羥基丁酸、膽堿等成分的含量易波動。進一步分析得出，氨基酸代謝、酮體代謝、膽堿代謝等體內(nèi)代謝途徑在不同批次大鼠間存在一定的波動性。該研究為評價健康大鼠之間的批次一致性提供了一種新的思路，也為準確地確定血液生物標志物奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：代謝組學；血清；大鼠；生物樣本；1H NMR

生命科學研究中，最常用的實驗動物品種有小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、狗等。由美國Spargue Dawley農(nóng)場育成的SD大鼠憑借生長發(fā)育較快、抗病能力強、繁育性能好等特點而廣泛用于安全性試驗及營養(yǎng)與生長發(fā)育有關(guān)的研究[1-2],此外，SD大鼠還是藥物藥效、毒理研究等最常用的實驗動物模型之一。在藥物研究中，實驗動物的質(zhì)量及批次之間的穩(wěn)定、均一性對藥物藥效、毒理研究結(jié)果的重現(xiàn)性有重要影響。目前，SD大鼠的繁殖飼養(yǎng)基地一年四季均可提供實驗大鼠，不同批次繁殖的大鼠間是否存在一定差異？生化指標、病理切片等可以靈敏地反映動物在疾病狀態(tài)下的差異，但對于健康動物則難以評價批次之間的一致性，而代謝組學則可從機體代謝的角度靈敏地檢測和反映這一問題。

代謝組學是一門通過考察生物體系受刺激或擾動后其內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化來研究生物體系的學科，一般借助高通量、高靈敏度與高精確度的現(xiàn)代分析技術(shù)分析細胞、組織以及體液等生物樣本中內(nèi)源性代謝物的整體變化。與基因組學和蛋白組學相比，代謝組學位于系統(tǒng)生物學的最下游，能更準確地反映生物體系的狀態(tài)，是生物體系整體功能或狀態(tài)最終結(jié)果的表現(xiàn)[3-5]。核磁共振(NMR)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)等分析技術(shù)常與數(shù)學模型和化學統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析等方法相結(jié)合來分析研究復雜生物系統(tǒng)的代謝物。其中，NMR的代謝組學技術(shù)因具有重復性好、備樣簡單、無損傷性的優(yōu)點而得到廣泛應用[6-10]。代謝組學研究中常用的大鼠生物樣本有血液、尿液以及肝臟、腎臟等組織提取液，其中由于血液、尿液可以連續(xù)多次獲取，并且包含豐富的代謝物信息，在代謝組學研究中最為常用[11]。

本實驗擬采用核磁共振技術(shù)檢測同一繁殖基地不同批次的健康SD大鼠血清，利用多元統(tǒng)計分析和單變量分析等手段分析其血液代謝成分，探討不同批次動物之間在機體代謝上的差異性。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

Bruker 600-MHz Avance Ⅲ NMR Spectrometer(600.13 MHz質(zhì)子頻率，德國布魯克公司600兆核磁儀)，TGL-16高速臺式冷凍離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)，核磁試劑重水(Norell，Landisville，美國)，三甲基硅烷丙酸鈉鹽(TSP，Cambridge Isotope Laboratories Inc.，MA，美國)，氘代氫氧化鈉(Armar，Switzerland)，磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉(分析純，天津市光復精細化工研究所)。

1.2血清樣本處理

SPF級雄性SD成年大鼠，體重(200±20)g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號 SCXK(京)2012-0001，訂購時間分別為2014年3月，2014年9月，2014年11月，2015年4月，根據(jù)訂購時間依次分為A、B、C、D 4組，每組6只。適應性飼養(yǎng)1周后收集SD大鼠的血液，3 000 r/min離心15 min，取上清液，轉(zhuǎn)移至EP管中，-80 ℃冰箱保存，備用。

血清樣品在冰水中解凍，精密吸取450 μL置于EP管中，加入350 μL D2O，渦旋30 s，于4 ℃、13 000 r/min離心20 min，取上清液600 μL，轉(zhuǎn)移至5 mm的核磁管中，進行核磁分析。

1.31H NMR測試條件

Bruker 600 MHz AVANCE Ⅲ NMR 譜儀采集數(shù)據(jù)，脈沖序列Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)，掃描次數(shù)64，譜寬為12 345.7 Hz，脈沖時間14 μs，采樣時間2.654 s，弛豫時間1.0 s，采樣數(shù)據(jù)點65 536，F(xiàn)ID分辨率0.188 Hz，采樣間隔40.5 μs，內(nèi)標為TSP。A、B、C、D 4組大鼠血清的采譜時間分別為2014年4月16日、2014年12月28日、2015年1月25日、2015年4月24日。

1.41H NMR圖譜處理

采用MestReNova(Version 8.0.1，Mestrelab Research，Santiago de Compostella，Spain)核磁圖譜處理軟件對所有1H NMR圖譜進行傅立葉轉(zhuǎn)換以及相位、基線調(diào)整，以肌酸(δ3.04)為標準對譜圖進行化學位移的校正。以δ0.01分段積分區(qū)間對化學位移區(qū)間δ0.70~8.60進行分段積分，其中δ4.66~5.94(殘余水峰)不進行積分。

1.5統(tǒng)計學分析

積分歸一化后的數(shù)據(jù)導入SIMCA-P 13.0(Umetrics，瑞典)進行主成分分析(PCA)，所選的數(shù)據(jù)預處理方式為Unit Variance。隨后采用GraphPad PRISM 5.01 軟件對所有指認的成分進行單變量分析，并將數(shù)據(jù)導入SPSS 16.0中進行單變量方差分析(One-Way ANOVA)。

2結(jié)果與討論

2.11H NMR圖譜的指認與分析

通過化學位移、耦合常數(shù)及峰形等核磁數(shù)據(jù)分析，結(jié)合標準品、數(shù)據(jù)庫HMDB(http://www.hmdb.ca/)、BMRB(http://bmrb.wisc.edu/)和文獻[12-13]數(shù)據(jù)對照對所得圖譜(圖1)進行指認，從血清中共指認了30種化合物，包括氨基酸、有機酸、糖類等。

2.2多元統(tǒng)計分析

主成分分析是一種對多元數(shù)據(jù)降維的數(shù)據(jù)處理方法，通過將原來眾多具有一定相關(guān)性的指標，重新組合成一組新的互相無關(guān)的綜合指標代替原指標，來考察多個變量間的相關(guān)性。如圖2所示，對不同批次的SD大鼠血清進行主成分分析，由前兩個主成分構(gòu)建的得分圖可以直觀地看出，所有樣本點均在95%置信區(qū)間內(nèi)，說明本次實驗所得數(shù)據(jù)均無特異點。4個批次的SD大鼠血清代謝物位于圖中4個不同位置，可以明顯分開，說明不同批次的SD大鼠血清代謝物組成明顯不同。PLS-DA分析(Partial Least Squares-Discriminant Analysis，偏最小二乘法判別分析)的模型驗證圖如圖3所示，從模型驗證圖可看出，綠色和藍色的回歸線與左側(cè)縱軸相交，且左側(cè)的R2、Q2實驗值低于右側(cè)的原始值，說明模型是可靠有效的，即模型驗證成立，說明4個組的分離具有統(tǒng)計學意義。

圖1　大鼠血清樣本的1H NMR圖譜

2.3單變量分析

圖2　不同批次SD大鼠血清的PCA分析Fig.2　PCA score plots of serum samples from different batches of SD ratsA,B,C and D represent different batches of healthy SD rats，respectively(A、B、C、D分別代表不同批次健康SD大鼠)

圖3　不同批次SD大鼠血清的PLS-DA模型驗證圖Fig.3　PLS-DA model validation of serum samples from different batches of SD rats

為確定4批SD大鼠在血清內(nèi)源性代謝物上的差異，進一步對SD大鼠血清中指認出的代謝物進行單變量分析，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，不同批次的SD大鼠血清中代謝產(chǎn)物的含量有一定差異。A組中的丙酮酸含量較其他組更高，而3-羥基丁酸、琥珀酸、肌酸、乙酰乙酸等有機酸及膽堿、PC、GPC的含量較低。B組中亮氨酸、?；撬岷虶PC的含量較多，丙酮酸及脂類成分的含量較少。C組的氨基酸含量整體較其他組高，如異亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、精氨酸，此外膽堿、PC及脂類的含量也比其他組高；而乙酸、檸檬酸和糖類的含量較低。與其他三組相比，D組中3-羥基丁酸、乙酸、琥珀酸等有機酸類成分的含量較高，而異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸、賴氨酸等氨基酸含量普遍較低。

對上述差異代謝物進行ANOVA方差分析，可知檸檬酸、丙酮酸、琥珀酸、谷氨酰胺、二甲基甘氨酸等成分的含量相對穩(wěn)定，而丙氨酸、精氨酸、異亮氨酸、乳酸、3-羥基丁酸、膽堿等成分的含量更容易波動，在不同的組間存在顯著性差異。

2.4代謝途徑分析

丙氨酸、精氨酸、異亮氨酸、乳酸、3-羥基丁酸、膽堿等成分在各組間的含量差異較大。丙氨酸和精氨酸是生糖氨基酸，異亮氨酸是兼容生糖生酮氨基酸，主要參與生酮途徑。這些氨基酸在不同組別的SD大鼠血清中有一定的波動，表明不同批次SD大鼠的氨基酸代謝途徑有一定的差異性。乳酸是參與糖酵解過程無氧呼吸的主要代謝物，3-羥基丁酸參與機體的酮體代謝，膽堿、磷脂酰膽堿(PC)與體內(nèi)磷脂的生物合成有關(guān)[14]，說明不同批次SD大鼠的這些代謝途徑容易波動。檸檬酸、琥珀酸、谷氨酰胺、二甲基甘氨酸等成分在各組的含量相對穩(wěn)定。檸檬酸和琥珀酸是三羧酸循環(huán)中重要的中間代謝產(chǎn)物，說明三羧酸循環(huán)這一代謝途徑相對穩(wěn)定。二甲基甘氨酸是甘氨酸的衍生物，在線粒體中提供甲基參與葉酸代謝[15]，與體內(nèi)蛋白質(zhì)合成和機體的應激能力也有一定關(guān)系[16]，其在不同組別SD大鼠中的含量相近，說明參與的代謝途徑相對穩(wěn)定。

3結(jié)論

本研究采用核磁代謝組學技術(shù)對不同批次的健康SD大鼠血清進行分析，結(jié)果表明不同批次的健康大鼠在機體代謝上存在一定差異，這種差異與丙氨酸、精氨酸、異亮氨酸、乳酸、3-羥基丁酸、膽堿等成分的波動有關(guān)，這些波動成分涉及的代謝途徑包括氨基酸代謝、酮體代謝、膽堿代謝等。

大鼠是生命科學研究中常用的實驗動物，批次之間的一致性對實驗結(jié)果的重現(xiàn)性至關(guān)重要。除飼養(yǎng)時期的不同之外，其他因素如大鼠性別、體重、飼養(yǎng)條件等也是動物實驗設(shè)計的干擾因素。在外界刺激較大時，如給藥或手術(shù)導致的疾病模型，批次之間的差異因素可能不會對實驗結(jié)果有太大的影響，但當刺激或?qū)Υ笫蟮母深A比較溫和時，如食品的代謝組學作用研究，實驗動物批次之間的一致性、機體代謝差異性則會對實驗結(jié)果產(chǎn)生一定影響。

代謝組學可以靈敏地反映機體生理狀態(tài)的差異，本研究為評價健康大鼠之間的批次一致性提供了一種新思路。此外，在代謝組學研究中，血液中內(nèi)源性成分常被作為生物標志物，并用于疾病的早期診斷或藥物的藥效評價，明確血液內(nèi)源性代謝物在生理狀態(tài)的波動性及差異性，也可為準確地確定生物標志物奠定基礎(chǔ)。

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Metabolomic Comparison of Serum Samples in Different Groups of SD Rats

ZHANG Song1，LI Zhen-yu2*，QIN Xue-mei2*

(1.Nuclear Magnetic Resonance Detecting Laboratory，Shanxi Academy of Analytical Sciences，Taiyuan030006，China；2.Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine，Shanxi University，Taiyuan030006，China)

Abstract：To explore the differences in body metabolism of experimental animals，the serum samples of four batches of healthy SD rats raised in different periods were compared using proton nuclear magnetic resonance(1H NMR) based metabolomic approach combined with multivariate statistical analysis.The results showed that the contents of several serum metabolites in different groups，including citric acid，pyruvic acid，succinic acid，glutamine，dimethylglycine，changed slightly，while the amounts of alanine，arginine，isoleucine，lactic acid，3-hydroxybutyric acid and choline were fluctuant.Further metabolic pathways analysis showed that amino acid metabolism，ketone body metabolism and choline metabolism were fluctuant in different groups of SD rats.This study provided a new method for the evaluation on the consistency among the different groups of healthy SD rats，and laid a basis for further determination on the biomarkers in serum samples.

Key words：metabolomics；serum；rats；biological samples；1H NMR

中圖分類號：O482.532；S852.5

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)02-0200-06

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.02.011

*通訊作者：李震宇，博士，副教授，研究方向：中藥質(zhì)控與代謝組學，Tel:0351-7011202，E-mail:lizhenyu@sxu.edu.cn

收稿日期：2015-08-31；修回日期：2015-09-20

秦雪梅，博士，教授，研究方向：中藥質(zhì)控、評價與代謝組學，Tel:0351-7018379，E-mail:qinxm@sxu.edu.cn