高蕾　郁蘭芳

314300 嘉興，浙江省海鹽縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科(高蕾)；310003杭州，浙江大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤內科(郁蘭芳)

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瞬時受體電位C1對人卵巢癌細胞ES-2增殖和凋亡的影響

高蕾郁蘭芳

314300 嘉興，浙江省海鹽縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科(高蕾)；310003杭州，浙江大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤內科(郁蘭芳)

【摘要】目的探討瞬時受體電位C1(TRPC1)對人卵巢癌細胞ES-2增殖和凋亡的影響。方法利用熒光定量PCR檢測人卵巢癌細胞ES-2、SKOV3、OV1以及OV2和正常卵巢上皮細胞IOSE80中TRPC1的表達水平。設計并合成靶向TRPC1的特異性短發(fā)卡RNA(shRNA)，通過脂質體轉染TRPC1表達最高的人卵巢癌細胞ES-2以構建穩(wěn)定低表達TRPC1細胞株ES-2/shRNA，通過蛋白免疫印跡法和熒光定量PCR檢測shRNA的干擾效率、MTT比色法檢測干擾后細胞的增殖能力、流式細胞儀檢測細胞凋亡情況、蛋白免疫印跡法檢測磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、細胞周期素D1(Cyclin D1)以及B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)的表達水平。結果在4種卵巢癌細胞株中，ES-2 的TRPC1表達水平最高。特異性靶向轉染TRPC1 shRNA能夠有效下調ES-2細胞中TRPC1表達水平；ES-2/shRNA細胞的增殖速度較轉染空白載體的ES-2/Con及ES-2細胞明顯減慢(P<0.01)。ES-2/shRNA細胞的凋亡率明顯高于ES-2/Con及ES-2細胞(P<0.01)。TRPC1干擾組細胞的p-PI3K、Cyclin D1以及Bcl-2的蛋白表達強度比ES-2/Con及ES-2明顯減弱。結論采用RNA干擾技術能夠有效沉默ES-2細胞的TRPC1基因，并致使其細胞增殖能力下降以及細胞凋亡率升高，其中可能的機制為通過對細胞因子PI3K的調控影響人卵巢癌細胞的增殖和凋亡。

【關鍵詞】瞬時受體電位C1；增殖；凋亡；卵巢癌

在女性生殖器官惡性腫瘤中，卵巢癌發(fā)病率占第3位，然而病死率一直位居首位。究其原因，大多數(shù)卵巢癌發(fā)病隱匿，約75%的患者在發(fā)現(xiàn)時已屬于晚期。針對晚期卵巢癌，癌細胞減滅術加紫杉醇或鉑類聯(lián)合化學治療，能暫時緩解疾病進展，但是腫瘤復發(fā)率卻在80%以上[1-4]。因此，迫切需要尋找卵巢癌的治療新方法。隨著分子生物學的飛速發(fā)展，分子靶向治療已成為當今卵巢癌防治研究的熱點。瞬時受體電位C1(TRPC1)是瞬時受體電位通道蛋白(TRP)家族中的一員，可通過調節(jié)鈣離子內流參與細胞多種生理及病理活動。既往研究表明，TRP與多種腫瘤的發(fā)生及預后密切關聯(lián)[5-6]。本研究擬采用特異性靶向TRPC1的短發(fā)夾RNA(shRNA)轉染卵巢癌細胞株ES-2，篩選并構建低表達TRPC1的穩(wěn)定細胞株，通過對比轉染空載體的對照組細胞，觀察TRPC1基因表達變化對ES-2細胞增殖和凋亡的影響，初步探討TRPC1在人卵巢癌細胞中的分子作用機制。

材料與方法

一、細胞培養(yǎng)

人卵巢癌細胞株ES-2、SKOV3、OV1以及OV2與正常卵巢上皮細胞株IOSE80購自中國科學院上海細胞庫。5株細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培基中，并置于5%CO2以及37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞長至約80%用含依地酸二鈉(EDTA)的胰酶消化并傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

二、TRPC1的特異性shRNA轉染

TRPC1 shRNA購自美國Santa Cruz公司(Cat. sc-270467-SH)。采用脂質體轉染技術，具體操作流程參照英韋創(chuàng)津公司的Lipofectamine2000產(chǎn)品說明書。轉染48 h后加入篩選抗生素G418，濃度為400 μg/ml，維持培養(yǎng)6 d后，G418濃度改為200 μg/ml；細胞擴增后，提取蛋白和RNA，進行熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法鑒定。

三、TRPC1 mRNA表達水平的檢測

采用熒光定量PCR法檢測。穩(wěn)定轉染后，用Trizol提取總RNA，計算各組RNA濃度和純度，根據(jù)試劑盒說明書進行逆轉錄反應：42℃反應60 min，95℃ 5 min，4℃ 5 min。熒光定量PCR：將反應管置入ABI7500系統(tǒng)中，設置反應條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，共45個循環(huán)。引物序列如下： TRPC1上游5’-GATGTGCTTGGGA-GAAATGC-3’，下游5’-CAAGACGAAACCTGGAATGC-3’，長度232 bp； 內參GAPDH上游5’- ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’， 下游5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，長度452 bp。該實驗重復3次。

四、TRPC1蛋白表達水平的檢測

采用蛋白免疫印跡法檢測。TRPC1、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、細胞周期素D1(Cyclin D1)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)以及GAPDH抗體均購自美國abcam公司。提取細胞總蛋白后，采用BCA法定量計算總蛋白濃度，蛋白質凝膠電泳后轉膜，室溫封閉1 h，加入第一抗體(TRPC1、p-PI3K、Cyclin D1以及Bcl-2)，4℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育1 h。采用化學發(fā)光法檢測相關蛋白表達并進行灰度分析。該實驗重復3次。

五、MTT比色法檢測細胞增殖能力

取對數(shù)生長期的穩(wěn)定轉染TRPC1特異性shRNA的ES-2細胞，經(jīng)胰酶消化后，對其進行細胞計數(shù)，以每孔5×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，ES-2/shRNA、ES-2/Con及ES-2細胞分別設置3個復孔，并設空白對照孔(不加shRNA，僅加培養(yǎng)基)，分別培養(yǎng)24、48、72 h。用MTT法檢測570 nm波長處各個小孔的光密度(OD)值， 并繪制生長曲線。

六、細胞凋亡實驗

ES-2/shRNA、ES-2/Con及ES-2細胞分別接種于6孔板的小孔中：棄RPMI1640培養(yǎng)基，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞，胰酶消化細胞，收集于小離心管中，低速離心5 min，棄上清液。按Annexin V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒說明書操作，完成后用流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

七、統(tǒng)計學處理

結果

一、細胞TRPC1 mRNA表達水平

相對于正常卵巢上皮細胞IOSE80(設定為1)，4株人卵巢癌細胞(ES-2、SKOV3、OV1以及OV2細胞)的TRPC1 mRNA的相對表達量分別為5.02±0.08、3.23±0.05、1.78±0.08、2.13±0.04，見圖1。因ES-2的TRPC1 mRNA表達水平最高，故選擇ES-2作為研究對象進行下一步實驗。

圖1　TRPC1 mRNA在4株人卵巢癌細胞和1株正常卵巢上皮細胞中的表達水平

二、特異性靶向TRPC1 shRNA穩(wěn)定轉染ES-2細胞后TRPC1的表達

特異性靶向TRPC1穩(wěn)定轉染ES-2細胞后，使用PCR及蛋白免疫印跡法驗證沉默效率。結果顯示，轉染TRPC1 shRNA的ES-2細胞(ES-2/shRNA)、轉染空載體的ES-2細胞(ES-2/Con)、未轉染的ES-2細胞間TRPC1 mRNA及蛋白表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義(F分別為48.374、42.542，P均<0.001)；與未轉染及轉染空載體的ES-2細胞相比，轉染TRPC1 shRNA的ES-2細胞mRNA(t分別為10.453、9.649，P均<0.01,圖2B)及蛋白表達水平均明顯降低(t分別為9.488、8.845，P均<0.01,圖2C)。

圖2　shRNA明顯抑制ES-2細胞的TRPC1表達

A：蛋白免疫印跡法檢測結果；B：mRNA定量結果；C：蛋白定量結果；與ES-2及ES-2/Con細胞比較，**P<0.01

三、TRPC1基因沉默對ES-2細胞增殖能力的影響

ES-2/shRNA、ES-2/Con、ES-2的增殖速度比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=53.251，P<0.001)，ES-2/shRNA細胞的增殖速度比ES-2/Con及ES-2細胞明顯減慢(F分別為48.857、37.413，P均<0.001)，ES-2/Con與ES-2細胞的增殖速度比較差異無統(tǒng)計學意義(F=0.645，P=0.481)，見圖3。

圖3　TRPC1對ES-2細胞體外增殖能力的影響

四、TRPC1基因沉默對ES-2細胞凋亡的影響

ES-2、ES-2/Con和ES-2/shRNA細胞的凋亡率分別為(17.2±3.4)%、(18.3±2.5)%，(34.1±4.7)%，3組細胞的凋亡率比較差異有統(tǒng)計學意義(F=32.220，P<0.001)。ES-2/shRNA細胞凋亡率明顯高于ES-2及ES-2/Con細胞(t分別為5.046、5.141，P均<0.01)。ES-2細胞凋亡率與ES-2/Con細胞比較差異無統(tǒng)計學意義(t=0.451，P=0.675)，見圖4。

五、TRPC1基因沉默對ES-2細胞的PI3K、Cyclin D1以及Bcl-2表達強度的影響

ES-2/shRNA細胞的Cyclin D1、Bcl-2、p-PI3K的表達均較ES-2和ES-2/Con細胞減弱,見圖5。

討論

卵巢癌是一種常見的婦科惡性腫瘤。由于卵巢癌早期缺少癥狀，癥狀缺乏特異性，篩查的作用有限，因此早期診斷比較困難， 多數(shù)患者在就診時已為晚期，而晚期病例的療效欠佳。因此，卵巢癌的早期診斷顯得非常重要[7]。鈣離子是細胞內信號傳導過程中重要的第二信使，細胞內鈣離子平衡的紊亂參與腫瘤細胞的多種生物學行為，如腫瘤的生長、轉移、侵襲和分化,是惡性腫瘤細胞發(fā)生、發(fā)展的重要因素[8]。TRP可通過介導鈣離子內流調節(jié)腫瘤細胞的生物學行為。TRPC1是一種非選擇性的陽離子通道，已被證實在前列腺癌、肺癌及乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達升高，并預示預后較差[9-12]。本研究表明，在人卵巢癌細胞中，TRPC1表達升高；通過RNA干擾法成功構建TRPC1低表達的ES-2細胞株后，發(fā)現(xiàn)ES-2/shRNA細胞的增殖能力較ES-2/Con和ES-2細胞下降。此外，ES-2/shRNA細胞的凋亡率比ES-2/Con和ES-2細胞升高。由此推測，TRPC1可能是卵巢癌的促癌基因。

圖4　TRPC1對ES-2細胞凋亡率的影響

圖5　TRPC1對ES-2細胞中PI3K、Cyclin D1以及Bcl-2表達的影響

PI3K/蛋白激酶B(AKT)信號通路已被證實和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。PI3K作為PI3K/AKT通路中重要的調節(jié)因子，其在腫瘤細胞增殖和凋亡過程中起著關鍵作用[13-14]。一方面，PI3K對Cyclin D1有著間接調節(jié)作用，其磷酸化之后可活化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)從而增加Cyclin D1 mRNA翻譯，進而促進細胞增殖；另一方面，PI3K磷酸化后活化AKT能夠直接磷酸化促凋亡分子BAD，而磷酸化的BAD與Bcl-2發(fā)生結聚，從而使游離的Bcl-2發(fā)揮抗凋亡作用；此外，PI3K還能通過磷酸化forkhead家族轉錄因子，從而抑制凋亡相關基因如Fas-L、IGFBP1和Bim的轉錄[15]。因此，我們推測TRPC1調控人卵巢癌細胞的增殖以及凋亡可能與PI3K/AKT通路相關。

為了驗證以上猜測，本研究檢測了人卵巢癌細胞ES-2細胞在TRPC1下調后，p-PI3K、CyclinD1以及Bcl-2的表達水平均比2個對照組明顯下降。提示了TRPC1調節(jié)人卵巢癌細胞的惡性行為的部分機制可能是通過對PI3K/AKT信號通路的調控，從而調節(jié)增殖以及凋亡相關因子的表達水平。然而值得注意的是，腫瘤發(fā)生、發(fā)展與多條信號通路相關，且這些信號通路之間可能還存在著交叉作用，下一步我們將對TRPC1在卵巢癌中的分子機制進行更全面及深入的研究。

綜上所述，本研究探討了TRPC1對人卵巢癌細胞增殖及凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)TRPC1可通過活化PI3K等因子促進腫瘤細胞的增殖及抑制其凋亡。這為進一步揭示TRPC1基因與卵巢癌的關系提供新的實驗依據(jù)，更為進一步探索卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制提供了新的思路。

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(本文編輯：林燕薇)

Effect of TRPC1 on proliferation and apoptosis of human ovarian carcinoma cell ES-2

GaoLei,YuLanfang.

DepartmentofGynaecology&Obstetrics,HaiyanPeople’sHospital,Jiaxing314300,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of transient receptor potential channel 1 (TRPC1) upon the proliferation and apoptosis of human ovarian carcinoma cell ES-2. MethodsThe expression levels of TRPC1 in human ovarian carcinoma cell ES-2, SKOV3, OV1 and OV2, and normal human ovarian epithelial cell ISOE80 were detected by fluorescent quantitative PCR. Specific short hairpin RNA (shRNA) targeting TRPC1 was designed, synthesized, and then transfected into the ES-2 cells with the highest expression of TRPC1 via liposome to construct ES-2/shRNA cell line stably and lowly expressing TRPC1. The interfering efficiency of shRNA was validated by western blot and fluorescent quantitative PCR. The proliferation and apoptosis of ES-2 were detected by using MTT assay and flow cytometry. The expression levels of phosphatidylinositol 3-kinase (p-PI3K), Cyclin D1 and B-cell lymphoma (Bcl-2) were measured by western blot. ResultsAmong four human ovarian carcinoma cell lines, ES-2 expressed the highest level of TRPC1. TRPC1-targeted shRNA could effectively down-regulate the expression level of TRPC1 in ES-2 cells. Compared with those of ES-2/Con and ES-2, the proliferation rate of ES-2/shRNA was significantly lower (P<0.01) whereas the apoptosis rate was considerably higher(P<0.01). The expression levels of p-PI3K, Cyclin D1 and Bcl-2 in the shRNA interference group were significantly down-regulated compared with those in the ES-2/Con and ES-2 cells. ConclusionsRNA interference technique can effectively silence the TRPC1 in ES-2 cells, decrease cell proliferation ability and enhance cell apoptosis, probably by regulating cytokine PI3K to affect the proliferation and apoptosis of human ovarian carcinoma cells.

【Key words】Transient receptor potential channel 1; Proliferation; Apoptosis; Ovarian carcinoma

(收稿日期：2015-08-02)

Corresponding author, Yu Lanfang

通訊作者，郁蘭芳

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.02.008

·基礎研究論著·