侯成成　潘宇航　黃祥奇　李秋霞　張曦　黃紅月　金歐

510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院風(fēng)濕免疫科(侯成成,潘宇航，李秋霞，張曦，黃紅月，金歐)，病理科(黃祥奇)

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NOD2在狼瘡性腎炎患者腎臟組織中的表達

侯成成潘宇航黃祥奇李秋霞張曦黃紅月金歐

510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院風(fēng)濕免疫科(侯成成,潘宇航，李秋霞，張曦，黃紅月，金歐)，病理科(黃祥奇)

【摘要】目的研究核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2(NOD2)即CARD15在狼瘡性腎炎(LN)患者腎臟組織中的表達和分布情況，探討NOD2在LN中的作用。方法收集25例行病理活組織檢查(活檢)LN患者的腎臟組織，另取因腎實質(zhì)性腫瘤行手術(shù)切除遠離腫瘤2 cm以外的4例正常腎臟組織作為對照，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測2組腎臟組織中NOD2的表達分布情況，實時熒光定量PCR(qPCR)檢測上述腎臟組織中NOD2 mRNA表達水平，分析LN患者NOD2 mRNA與臨床指標的相關(guān)性。結(jié)果LN患者腎臟組織中NOD2表達較正常腎臟組織增高(P<0.01)。Ⅱ型LN僅腎小管上皮細胞內(nèi)有少量NOD2表達，Ⅲ型和Ⅳ型LN腎小球上皮細胞(壁層上皮細胞、足細胞)、腎小管上皮細胞中均有NOD2表達，Ⅴ型LN腎小管上皮細胞內(nèi)NOD2表達明顯增強。Ⅱ~Ⅴ型腎臟組織中NOD2表達水平均比正常對照組升高(P均<0.01)，并且各型腎臟組織中NOD2表達水平由低至高排列為Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅲ型、Ⅳ型(P均<0.05)。qPCR檢測發(fā)現(xiàn)LN患者腎臟組織中NOD2 mRNA水平較正常組升高(P<0.01)。LN患者腎臟組織NOD2 mRNA表達水平與臨床指標無關(guān)(P均>0.05)。結(jié)論NOD2可能參與了LN的發(fā)病過程，可能是LN疾病進程中的一個重要炎癥介質(zhì)。

【關(guān)鍵詞】系統(tǒng)性紅斑狼瘡；狼瘡性腎炎；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2；

免疫組織化學(xué)染色；聚合酶鏈反應(yīng)

Nucleotide-binding oligomerization domain containing 2; Immunohistochemistry;

Polymerase chain reaction

SLE是一種可以導(dǎo)致全身多器官及系統(tǒng)受累的慢性自身免疫紊亂性疾病，在我國發(fā)病率約為70/100 000、患病率約1/1 000，我國SLE患者數(shù)量為全球最多[1]。狼瘡性腎炎(LN)是SLE患者最常見和最嚴重的并發(fā)癥[2]。研究LN的發(fā)病機制對SLE的治療及預(yù)后具有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)，模式識別受體(PRR)紊亂和各種免疫性疾病如SLE、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等有關(guān)[3]。PRR可以通過識別保守的分子模式去鑒別病原相關(guān)分子模式(PAMP)和損害相關(guān)分子模式(DAMP)。但是，額外的信號可能會誘發(fā)對機體有害的免疫反應(yīng)[4-6]。胞漿核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)樣受體(NLR)是PRR的一個新家族，可以識別胞外的PAMP，近年來越來越多的關(guān)注點開始集中于有關(guān)NLR的研究。NOD2(即CARD15)是NLR家族的一個典型成員，包含CARD結(jié)構(gòu)域，識別肽聚糖中的胞壁酰二肽(MDP)。近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)NOD2可能參與各種自體炎癥及自身免疫性疾病[7-12]。有關(guān)NOD2與SLE、LN之間關(guān)系的研究較少。為此，本研究收集了LN患者腎臟活組織病理檢查(活檢)組織、正常腎臟組織及其臨床生化及病理資料，觀察腎臟組織中NOD2的表達分布情況，探討NOD2在LN腎臟組織中表達的意義。

材料與方法

一、標本來源

收集2015年在我院風(fēng)濕免疫科住院并行活檢的25例LN患者腎臟組織(LN組)。25例LN患者中，男5例、女20例，年齡(26.5±4.1)歲，從發(fā)病至行腎穿刺明確診斷的病程(10.1±7.8)個月，SLE病情活動性評分(SLEDAI)為(11.5±1.1)分；補體C3、C4水平分別為(0.48±0.05)、(0.08±0.02)g/L。ESR(45.6±13.2)mm/h， CRP(4.13±0.22)mg/L；血尿素氮(6.78±2.01)μmol/L，血清肌酐(79.5±0.7)μmol/L，尿蛋白(0.89±0.14)g/d；LN病理分型為Ⅱ型5例、Ⅲ型6例、Ⅳ型8例、Ⅴ型6例。25例LN患者均經(jīng)B超引導(dǎo)下行腎臟穿刺活檢術(shù)證實為LN性腎炎病理改變，住院期間7例Ⅳ型LN患者接受500 mg的甲潑尼龍沖擊治療，其余患者根據(jù)病情的嚴重程度分別給予8~120 mg的甲潑尼龍治療。另取同期在我院因腎實質(zhì)性腫瘤行手術(shù)切除遠離腫瘤2 cm以外的4例正常腎臟組織作為對照(正常對照組)，經(jīng)病理證實基本為正常腎臟組織，且患者無原發(fā)性腎小球腎炎、腎小管及腎間質(zhì)疾病、高血壓病、糖尿病等繼發(fā)性腎臟疾病。上述患者均簽署了本院標本收集的知情同意書，腎穿刺活檢均是在確保患者安全的前提下進行的，且在行腎穿刺診斷明確之前均未給予腎上腺皮質(zhì)激素(激素)和免疫抑制劑治療。

二、主要試劑

包括：小鼠抗CARD15單克隆抗體(ab31488，Abcam公司，美國)；小鼠抗CD68單克隆抗體(ab955，Abcam公司，美國)；兔抗腎母細胞瘤WT-1單克隆抗體(ab89901，Abcam公司，美國)；辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠/兔IgG(谷歌生物公司)；二氨聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(谷歌生物公司)；濃縮型山羊血清(谷歌生物公司)；一抗稀釋液(谷歌生物公司)；Trizol總RNA抽提試劑(Invitrogen，美國)；PCR引物(Life公司，美國)；可去除DNA污染的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA，日本)；實時熒光定量試劑盒(TAKARA，日本)。

三、方　法

1. 標本采集

將上述29例腎臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。另外收集上述25例LN患者中的6例患者的額外少許腎臟組織(Ⅲ型2例、Ⅳ型2例、Ⅴ型2例)及上述4例正常腎臟組織少許，先加入液氮研磨，然后加Trizol提取mRNA，再行實時熒光定量PCR(qPCR)檢測。

2. 腎臟切片的病理評價

所有LN患者的腎臟組織都是在B超定位下采用自動活檢針完成的。病理診斷由本院病理科醫(yī)師完成。病理分型根據(jù)2003年國際腎臟病學(xué)會和腎臟病理學(xué)會有關(guān)LN的最新分型方案，分為：Ⅰ型系膜輕微病變性LN、Ⅱ型系膜增殖性LN、Ⅲ型局灶性LN、Ⅳ型彌漫性LN、Ⅴ型膜性LN、Ⅵ型終末硬化性LN[13]。

3. 腎臟組織中NOD2、CD68、WT-1表達水平的檢測

CD68是單核細胞、巨噬細胞的特異性標記分子，由于NOD2已被發(fā)現(xiàn)可以表達在該類炎癥細胞中，而LN患者腎臟組織中多有單核細胞及巨噬細胞的浸潤，為觀察NOD2在LN腎臟組織中的表達分布情況，本研究對腎臟組織進行連續(xù)切片，并依次對NOD2、CD68采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(SP)染色(CD68陽性地方提示為單核細胞和巨噬細胞)。以3.0 μm厚作連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性抗原后，采用高壓修復(fù)方式暴露抗原，5%的山羊血清室溫封閉30 min后，棄除組織表面的山羊血清，每例組織連續(xù)作3張切片，標本依次滴加50 μl抗人CARD15的小鼠單克隆抗體(1∶100稀釋)、50 μl抗CD68的小鼠單克隆抗體(1∶200稀釋)、50 μl磷酸鹽緩沖液(陰性對照)，37℃組化濕盒孵育1 h。將切片用磷酸鹽緩沖液沖洗后，每張切片組織滴加50 μl HRP二抗(Dako Envision復(fù)合物)，37℃組化濕盒孵育30 min，DAB顯色，光鏡觀察中止反應(yīng)，蘇木素染核，自來水返藍終止顯色，乙醇脫水后放入60℃恒溫箱烘烤1 h后，放入二甲苯浸泡，取出切片，中性樹膠封片，室溫晾干。為證實NOD2在Ⅳ型LN腎小球內(nèi)的具體表達細胞，本研究對8例Ⅳ型LN患者的連續(xù)切片行NOD2、WT-1染色(WT-1是足細胞的特異性標記分子)，分別加一抗NOD2(1∶100稀釋)、WT-1(1∶200稀釋)，其余步驟同前述。

4. 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定

NOD2(即CARD15)陽性信號為棕黃色顆粒，定位于細胞質(zhì)。CD68陽性信號為棕黃色顆粒，定位于細胞質(zhì)。WT-1陽性信號為褐色，定位于細胞核。于顯微鏡下定位拍片，采用Bresalier半定量評分評價染色結(jié)果：雙盲法在每張切片中隨機選取10個視野，根據(jù)細胞染色強度分為4級，陰性染色計0分、淺黃色顯色計1分、棕黃色顯色計2分、棕褐色顯色計3分，計算每一強度染色在該視野中所占的百分比，分別計算每個視野中各染色強度分值與其視野所占百分比的乘積之和，10個視野的平均值就是整張切片免疫組化染色定量結(jié)果。具體公式如下：染色強度得分(IS)=Σ(0×F0+1×F1+2×F2+3×F3)。

5. 腎臟組織中NOD2 mRNA表達水平檢測

使用qPCR檢測。采用Trizol提取腎臟細胞中的總RNA，紫外線分光光度計測濃度。當測量標本的光密度260/280比值位于1.8左右時，方可進行后續(xù)實驗。根據(jù)測量結(jié)果將RNA濃度稀釋至約200 μg/μl，再次測量得到準確濃度后進行RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取等量RNA(500 ng)，按照試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，將逆轉(zhuǎn)錄得到的模板DNA進行PCR擴增，總體系20 μl。引物序列：NOD2上游5’-ACCTTTGATGGCTTTGACG-3’，下游5’-CACCTT GCGGGCATTCTT-3’；GAPDH上游5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游5’-GAAGAT GGTGATGGGATTTC-3’。反應(yīng)條件： 95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 5 s、60℃ 34 s共40個循環(huán)，95℃ 15 s、60℃ 60 s、95℃ 15 s延伸。實驗重復(fù)3次，GAPDH作為對照基因，計算目的基因NOD2的2-△△Ct值，比較LN組與正常對照組的NOD2 mRNA的表達水平。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果

一、腎臟組織的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

NOD2(即CARD15)、CD68的連續(xù)腎臟組織切片染色發(fā)現(xiàn)，NOD2可表達在炎癥細胞以外的腎臟固有細胞中。NOD2在正常腎臟組織的腎小球和腎小管內(nèi)有少量表達，而在LN腎臟組織表達明顯增多(t=9.104，P<0.001)。不同病理類型LN腎臟組織NOD2表達水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=69.333，P<0.001)。Ⅱ型LN僅腎小管上皮細胞內(nèi)有少量NOD2表達，Ⅲ型和Ⅳ型LN腎小球上皮細胞(壁層上皮細胞、足細胞)、腎小管上皮細胞中均有NOD2表達，Ⅴ型LN腎小管上皮細胞內(nèi)NOD2表達明顯增強，正常對照組均未見著色，見圖1。Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型腎臟組織中NOD2表達水平均比正常對照組升高(t分別為9.733、15.075、15.303、16.330，P均<0.001)，Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型的腎臟組織中NOD2表達水平均高于Ⅱ型(t分別為9.179、14.912、13.212，P均<0.001)，Ⅳ型的腎臟組織中NOD2表達水平高于Ⅲ型(t為2.777，P<0.05)，Ⅲ型、Ⅳ型的LN腎小管上皮細胞內(nèi)NOD2表達水平均高于Ⅴ型(t分別為2.917、7.258，P均<0.05)，見表1。8例Ⅳ型LN患者的連續(xù)切片行NOD2、WT-1染色，可見Ⅳ型LN患者的足細胞內(nèi)有NOD2的表達，見圖2。

圖1　不同病理類型LN組織與正常腎臟組織的NOD2表達(通用型二步法染色，×200倍)

A~C：正常對照腎臟組織的陰性對照染色、NOD2染色、CD68染色結(jié)果；D~F：Ⅱ型LN腎臟組織的陰性對照染色、NOD2染色、CD68染色結(jié)果；G~I：Ⅲ型LN腎臟組織的陰性對照染色、NOD2染色、CD68染色結(jié)果；J~L：Ⅳ型LN腎臟組織的陰性對照染色、NOD2染色、CD68染色結(jié)果；M~O：Ⅴ型LN腎臟組織的陰性對照染色、NOD2染色、CD68染色結(jié)果

表1　LN與正常腎臟組織的NOD2

注：與正常對照組比較，aP<0.01，bP<0.05；與Ⅱ型LN組比較，cP<0.01；與Ⅲ型LN組比較，dP<0.05；與Ⅳ型LN組比較，eP<0.01

二、腎臟組織的NOD2 mRNA表達水平檢測結(jié)果

LN組腎臟組織NOD2mRNA表達水平是正常對照組的4.4倍，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(7.77±1.69vs. 1.77±0.88，t=-5.579、P=0.001)，見圖3。

三、LN患者NOD2 mRNA與臨床指標的相關(guān)性

對6例同時行免疫組織化學(xué)染色及熒光定量PCR的LN患者腎臟組織NOD2 mRNA水平和LN的臨床指標行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LN患者的腎臟組織NOD2 mRNA水平與SLEDAI、補體(C3、C4)、ESR、CRP、血清白蛋白、血清肌酐、血尿素氮、尿蛋白定量等臨床指標均無關(guān)(P均>0.05)，見表2。

討論

SLE是一種復(fù)雜的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，以多系統(tǒng)受累出現(xiàn)多種臨床表現(xiàn)為特征，腎臟是最為為常見的受累器官，故LN的治療對SLE的病情控制及預(yù)后極為重要[15]。隨著社會的發(fā)展和醫(yī)學(xué)的進步，SLE的治療措施日趨完善，其生存率較以前大大提高。但是，目前LN的治療主要應(yīng)用激素和免疫抑制劑，起到緩解病情的作用，且不良反應(yīng)較大。因此，探討和闡明LN的發(fā)病機制，尋求有效的治療措施，尤其是靶向治療，對于改善患者病情和提高患者生存質(zhì)量具有重要作用。

圖2?、粜蚅N的連續(xù)切片中NOD2與WT-1的表達(通用型二步法染色，×200倍)

A：陰性染色；B：NOD2染色；C：WT-1染色

表2　LN患者NOD2 mRNA與臨床指標的相關(guān)性

圖3　LN組與正常對照組的腎臟組織NOD2 mRNA表達比較

與正常對照組比較，*P<0.01

LN是由大量免疫復(fù)合物沉積而介導(dǎo)的一種自身免疫性腎小球腎炎。既往多項研究發(fā)現(xiàn)，大量細胞炎癥因子參與了LN的免疫炎癥反應(yīng)，促炎因子和抗炎因子之間的失衡程度決定了炎癥的嚴重性和腎臟的損傷程度。NLR是機體激活固有免疫和誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫對抗病原微生物的重要分子[16]。其中最有代表性的是NOD1和NOD2，作用于共同的下游分子受體關(guān)聯(lián)蛋白2(RIP2)即RICK，其含有絲氨酸、蘇氨酸激酶，并具有CARD結(jié)構(gòu)。NOD1和NOD2識別細胞內(nèi)PAMP或內(nèi)源性危險信號后誘導(dǎo)自身寡聚化，募集下游RIP2，并與RIP2發(fā)生嗜同種CARD-CARD相互作用，隨后RIP2與IKK復(fù)合物(IKKC)相互作用，使NOD1或NOD2與IKKC連接，活化IKK，從而激活NF-κB，促進TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18等促炎細胞因子的轉(zhuǎn)錄。近年來,NOD2已經(jīng)成為NLR家族廣為研究的成員之一，被發(fā)現(xiàn)可能參與各種炎癥及自身免疫性疾病[7-9]。既往研究發(fā)現(xiàn)，NOD2廣泛表達于樹突狀細胞、巨噬細胞、潘氏細胞、腸上皮細胞、肺上皮細胞及口腔上皮細胞中，其基因的變異已被證實與克羅恩病、Blau 綜合征及哮喘相關(guān)。NOD2可以被胞壁酰二肽類(MDP)激活，通過關(guān)聯(lián)識別，NOD2經(jīng)歷了一個構(gòu)象改變、NOD區(qū)域的寡聚體化從而引發(fā)RIP2的募集。隨后NOD2的CARD與RIP2的CARD區(qū)域通過相互關(guān)聯(lián)而結(jié)合，導(dǎo)致包括NF-κB、MAPK等多條信號通路的激活和促炎因子的產(chǎn)生。2010年首次發(fā)現(xiàn)NOD2在人和小鼠的腎小管上皮細胞表達[17]。NOD2敲除后可以明顯改善腎缺血再灌注引起的損傷[18]。后來，Du等[19]發(fā)現(xiàn)NOD2也表達于糖尿病患者的腎小球系膜細胞、內(nèi)皮細胞和足細胞中，且發(fā)現(xiàn)NOD2是胰島素抵抗導(dǎo)致糖尿病腎病腎損傷信號傳導(dǎo)通路的重要成員之一，敲除NOD2的糖尿病小鼠尿蛋白及腎損傷的情況明顯改善。對于NOD2是否參與了LN的疾病進程，目前相關(guān)研究較少。有研究探討了NOD2基因多態(tài)性在歐洲人群和亞洲人群中SLE易感性中的相關(guān)性，僅一項數(shù)據(jù)指出NOD2的rs2066845等位基因似乎與SLE的發(fā)生風(fēng)險有關(guān)(OR=2.01，95%CI：1.01~4.03)[20]。

本研究通過免疫組織化學(xué)染色和PCR等方法初步檢測了LN患者腎臟組織NOD2的表達水平及分布情況。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果提示，正常對照組和Ⅱ型LN腎臟組織中NOD2表達較少，而Ⅲ、Ⅳ型LN腎臟組織中NOD2表達明顯增強，且多表達在腎小球上皮細胞(壁層上皮細胞和足細胞)及腎小管上皮細胞中，而在Ⅴ型LN腎臟組織中，NOD2主要在腎小管上皮細胞表達增強。這可能與Ⅲ型和Ⅳ型LN的病情活動性較強，腎小球病變及炎癥程度較重有關(guān)。熒光定量PCR結(jié)果也提示LN患者腎臟組織中NOD2 mRNA的表達水平較正常對照組明顯升高，說明NOD2可能參與了LN病程中的炎癥發(fā)生、發(fā)展過程。針對LN患者NOD2 mRNA水平和臨床指標的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，腎臟組織中NOD2 mRNA水平與其臨床指標均無關(guān)，這與之前在糖尿病腎病中的研究結(jié)果一致[19]。但由于行熒光定量的新鮮SLE腎臟組織收集困難，導(dǎo)致樣本量不大，可能無法真正反映其與臨床指標的相關(guān)性，日后還需擴大樣本量進一步驗證。

綜上所述，LN患者腎臟組織中NOD2表達增加，提示NOD2可能參與了LN的疾病進展，但是尚需要擴大樣本量及進一步行體外細胞模擬實驗、動物實驗深入研究，為阻止LN的進展提供理論基礎(chǔ)。

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(本文編輯：林燕薇)

Expression of NOD2 in renal tissue of patients with lupus nephritis

HouChengcheng,PanYuhang,HuangXiangqi,LiQiuxia,ZhangXi,HuangHongyue,JinOu.

DepartmentofRheumatologyandImmunology，theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity，Guangzhou510630,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and distribution of nucleotide-binding oligomerization domain containing 2 (NOD2) in the renal tissues of patients diagnosed with lupus nephritis (LN), and explore the potential role of NOD2 in LN. MethodsThe renal tissues were obtained from 25 LN patients undergoing pathological biopsy. The kidney sample > 2 cm from the tumors was collected from 4 healthy controls who received surgical resection of renal tumors. The expression and distribution of NOD2 in the renal tissues of LN patients and normal controls were detected by immunohistochemistry. The messenger RNA (mRNA) level of NOD2 in the renal tissues was detected by fluorescence quantitative-polymerase chain reaction (qPCR) between two groups. The correlation between NOD2 mRNA level and clinical parameters was analyzed. ResultsImmunohistochemistry results demonstrated that the expression of NOD2 in LN patients was significantly higher than that of normal controls (P<0.01). NOD2 was slightly expressed in the glomerular epithelial cells of patients with type Ⅱ LN, detected in the glomerular epithelial cells (parietal epithelial cells and podocytes) and renal tubular epithelial cells of type Ⅲ LN cases, and significantly up-regulated in the renal tubular epithelial cells of type Ⅴ LN patients. The expression levels of NOD2 in renal tissues listed from low to high was type Ⅱ, Ⅴ, Ⅲ and Ⅳ (all P<0.05). qPCR analysis revealed that the mRNA level of NOD2 in the renal tissues of LN patients was significantly up-regulated than that in normal controls (P<0.01). In LN patients, the mRNA level of NOD2 was not correlated with clinical parameters (P>0.05). ConclusionNOD2 may participate in the pathogenesis of LN, and probably serves as a pivotal inflammatory mediator during the progression of LN.

【Key words】Systemic lupus erythematosus; Lupus nephritis;

(收稿日期：2015-12-07)

Corresponding author, Jin Ou

通訊作者，金歐

基金項目：中華醫(yī)學(xué)會臨床醫(yī)學(xué)專項-風(fēng)濕病學(xué)發(fā)展與研究資金項目(12040700370)

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.02.009

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