李川　王冰　楊建旭　安靚

450000 鄭州，鄭州人民醫(yī)院病理科(李川)；450000 鄭州，河南省人民醫(yī)院肝移植科(王冰)，重癥監(jiān)護病房(楊建旭)；510515 廣州，南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所(安靚)

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E-cadherin和巢蛋白在鼻咽癌組織中的表達及臨床意義

李川王冰楊建旭安靚

450000 鄭州，鄭州人民醫(yī)院病理科(李川)；450000 鄭州，河南省人民醫(yī)院肝移植科(王冰)，重癥監(jiān)護病房(楊建旭)；510515 廣州，南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所(安靚)

【摘要】目的研究E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、巢蛋白、Ki67和P53在鼻咽癌組織中的表達及其臨床意義。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測E-cadherin、巢蛋白、Ki67和P53在鼻咽癌組織(鼻咽癌組)和鼻咽炎組織(對照組)中的表達情況，并分析E-cadherin和巢蛋白的表達與鼻咽癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果在鼻咽癌組織中E-cadherin和巢蛋白陽性表達率分別為11.63%和69.77%，在鼻咽炎組織中的陽性表達率分別為85.72%和9.52%，2組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；Ki67和P53在鼻咽癌組織中的陽性表達率分別為93.02%和88.37%，在鼻咽炎組織中的陽性表達率分別為9.52%和4.76%，2組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。E-cadherin在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達率分別為3.33%和30.77%， 巢蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達率分別為90.00%和23.08%，2組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，E-cadherin和巢蛋白的表達與其他病理參數(shù)無關(guān)(P>0.05)；巢蛋白的表達與E-cadherin的表達呈負相關(guān)(P<0.01)。 結(jié)論E-cadherin和巢蛋白的表達與鼻咽癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系，兩者有可能通過共同作用影響鼻咽癌的轉(zhuǎn)移。

【關(guān)鍵詞】E-鈣黏蛋白；巢蛋白；鼻咽癌；免疫組織化學(xué)

鼻咽癌是我國常見的一種頭頸部惡性腫瘤，因鼻咽黏膜下間質(zhì)富含淋巴組織，易早期發(fā)生淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。因此探討鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展機制，尋找鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子靶向治療靶點將為治療鼻咽癌提供新的思路和方法。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)是上皮組織中的一類依靠Ca2+的細胞間黏連跨膜糖蛋白分子，在維持細胞間黏附的穩(wěn)定和細胞極性中發(fā)揮重要作用。E-cadherin的表達與腫瘤的侵襲能力呈負相關(guān)。E-cadherin的表達下調(diào)或抑制會開啟上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，并導(dǎo)致腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移。巢蛋白是第四類中間絲蛋白，早期主要用于神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤干細胞的研究，新近研究發(fā)現(xiàn)巢蛋白在多種惡性腫瘤中均有表達，且巢蛋白的表達與腫瘤的惡性程度及遠處轉(zhuǎn)移率呈正相關(guān)[1-4]。本研究采用免疫組織化學(xué)的方法檢測鼻咽癌組織中E-cadherin、 巢蛋白及腫瘤預(yù)后指標Ki67和P53的表達情況，分析其與鼻咽癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。

對象與方法

一、研究對象

收集鄭州人民醫(yī)院2011年7月至2015年1月在病理科活組織檢查(活檢)確診為鼻咽癌的患者43例，男25例、女18例，年齡30～78歲，其中臨床分期Ⅰ期4例、Ⅱ期8例、Ⅲ期18例、Ⅳ期13例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例；非角化性癌35例，角化性鱗狀細胞癌8例。另外收集21例經(jīng)病理活檢確診為鼻咽部慢性炎癥患者作為對照組，其中男10例、女11例，年齡15～67歲。

二、試劑及方法

即用型鼠抗人單克隆抗體、SP檢測試劑盒、DAB顯色劑均購自福建邁新生物公司。新鮮切除標本立即10%福爾馬林固定，然后進行后續(xù)的制片。免疫組織化學(xué)方法采用SP法，按照試劑盒說明書方法染色。用PBS代替一抗為陰性對照，陽性對照采用已知強陽性表達的組織。

三、判斷標準

巢蛋白主要表達于腫瘤細胞細胞質(zhì)，E-cadherin主要表達于腫瘤細胞細胞膜或者細胞質(zhì)，Ki67和P53主要表達于腫瘤細胞細胞核。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。E-cadherin和巢蛋白等免疫標記物在不同組間表達差異采用χ2檢驗；E-cadherin和巢蛋白在鼻咽癌組織表達的相關(guān)性用交叉分類2×2列聯(lián)表的關(guān)聯(lián)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、E-cadherin、巢蛋白、Ki67和P53在鼻咽癌組和對照組表達的比較

鼻咽癌組織中，E-cadherin染色陽性細胞在細胞膜或者細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒(圖1A)；巢蛋白染色陽性細胞為細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒(圖1B)；Ki67和P53染色陽性細胞為細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒(圖1C、1D)。

鼻咽癌組E-cadherin、巢蛋白、Ki67和P53的陽性表達率與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，見表1、2。

表1　不同鼻咽組織中E-cadherin和巢蛋白的表達情況

表2　不同鼻咽組織中Ki67和P53的表達情況

圖1　E-cadherin、巢蛋白、Ki67和P53在鼻咽癌細胞中的表達(SP,×100)

A：E-cadherin在鼻咽癌細胞中的陽性表達；B：巢蛋白在鼻咽癌細胞中的陽性表達；C：Ki67在鼻咽癌細胞中的陽性表達；D：P53在鼻咽癌細胞中的陽性表達

二、鼻咽癌組織中E-cadherin和巢蛋白的表達與臨床病理特征的關(guān)系

E-cadherin和巢蛋白在鼻咽癌不同組織學(xué)類型非角化性癌和角化性癌中的陽性表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)；不同臨床分期的鼻咽癌組織中陽性表達比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組E-cadherin的陽性表達明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.644，P<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組巢蛋白的陽性表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=19.258，P<0.01)，見表3。

表3　E-cadherin和巢蛋白在鼻咽癌各臨床病理特征之間的關(guān)系

注：與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較，aP<0.001

三、E-cadherin和巢蛋白在鼻咽癌組織中表達的相關(guān)性

38例E-cadherin蛋白表達陰性的鼻咽癌組織中有29例巢蛋白表達陽性，9例表達陰性；5例E-cadherin蛋白表達陽性的鼻咽癌組織中有1例巢蛋白表達陽性，4例表達陰性。關(guān)聯(lián)分析顯示，E-cadherin和巢蛋白在鼻咽癌中表達呈負相關(guān)(P<0.01)。

討論

上皮細胞癌是人類惡性腫瘤的最常見類型，其轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的主要原因。細胞間的黏附作用對于維持組織細胞的正常形態(tài)及穩(wěn)定非常重要，當(dāng)其發(fā)生異常時，有可能會引起細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。E-cadherin是上皮組織中的一類依靠Ca2+的細胞間黏連跨膜糖蛋白分子，因此維持穩(wěn)定的細胞連接需要E-cadherin的存在，當(dāng)E-cadherin下調(diào)或者消失就破壞了細胞間的連接，在發(fā)育和腫瘤浸潤過程中,EMT隨著E-cadherin功能的喪失而發(fā)生。EMT是胚胎發(fā)育中的一個基本過程，它使在特殊部位產(chǎn)生的上皮細胞從上皮組織分離并遷移到其它位置，是正常發(fā)育、傷口愈合及惡性上皮腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ)。在細胞生長因子介導(dǎo)的絡(luò)氨酸或絲/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶受體、整合素及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的刺激下，導(dǎo)致E-cadherin的下調(diào)和細胞骨架蛋白的改變而發(fā)生EMT。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)是EMT的誘導(dǎo)劑，作用于受體Ser/Thr激酶從而使胞漿的Smads活化入核，激活抑制劑E-cadherin的Snail家族誘導(dǎo)EMT[1]。有文獻報道，在食管腺癌中，轉(zhuǎn)錄因子Slug通過抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄啟動子而抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，最終與其他信號分子一起參與EMT過程[5]。在黑色素瘤中，ET-1上調(diào)Snail mRNA,同時下調(diào)E-cadherin mRNA，ET-1在卵巢癌中誘導(dǎo)EMT，促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[6]。本研究顯示在鼻咽癌組織中E-cadherin的陽性表達率明顯低于對照鼻咽炎組織，分析其與鼻咽癌各臨床病理特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)E-cadherin的陽性表達率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，與鼻咽癌的組織學(xué)類型及臨床分期無關(guān)。提示E-cadherin的低表達可能與鼻咽癌的浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)。E-cadherin可能通過某種信號通路誘導(dǎo)開啟EMT，參與腫瘤細胞的遷移與侵襲。目前國內(nèi)還無相關(guān)研究。

巢蛋白最初被檢測到主要表達于胚胎發(fā)育時期的神經(jīng)干細胞和前體細胞，在成體中，巢蛋白僅在小部分的組織和細胞中表達，但在缺血、炎癥及腦損傷等病理狀態(tài)下，巢蛋白也呈現(xiàn)返祖性表達[7]。巢蛋白可表達于肝癌組織中的新生血管內(nèi)皮細胞，定量檢測并對比癌組織和癌旁組織巢蛋白的表達，結(jié)果顯示，兩者的表達強度之間存在著顯著差異，推測巢蛋白可以作為肝癌新生血管的標記物[8]。血管發(fā)生對于腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移是非常重要的。有文獻報道，高度血管化的腫瘤具有非常差的預(yù)后[9-11]。CD34和CD31是血管內(nèi)皮細胞標記，然而在增生的血管內(nèi)皮細胞卻只能檢測到巢蛋白的表達。基于這個原因，巢蛋白被認為是在生理和病理條件下新生血管的重要標記[12]。隨著對巢蛋白研究的深入，發(fā)現(xiàn)在多種類型的實體瘤中都檢測到巢蛋白的表達。并且發(fā)現(xiàn)巢蛋白的表達與腫瘤的惡性分型有很大的關(guān)系。2004年Thomas等[13]報道，低度惡性和低轉(zhuǎn)移潛力的神經(jīng)母細胞瘤歸因于低水平的巢蛋白的表達。在神經(jīng)外胚層腫瘤中，高水平的巢蛋白就意味著最惡性的細胞類型，在高轉(zhuǎn)移的人膠質(zhì)母細胞瘤和星形細胞瘤的浸潤部分，巢蛋白的表達增高，巢蛋白在黑色素瘤的腫瘤侵襲中也發(fā)揮作用[14-18]。生物信息學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)巢蛋白 DNA序列中含有與Snail/Slug高度親和的E-box序列，從而推測，巢蛋白可能通過Snail/Slug相互作用而參與腫瘤的轉(zhuǎn)移和惡性表型的發(fā)生過程。本研究結(jié)果表明在鼻咽癌組織中巢蛋白的陽性表達率明顯高于鼻咽炎組織，并且巢蛋白的陽性表達率與患者淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有關(guān)，與鼻咽癌的組織學(xué)類型及臨床分期無關(guān)。這個結(jié)果提示巢蛋白可能通過促進新生血管的生長及某些信號通路參與鼻咽癌的浸潤及轉(zhuǎn)移。

本實驗初步分析了E-cadherin和巢蛋白在鼻咽癌組織中陽性表達的相關(guān)性，兩者呈負相關(guān)。最近研究結(jié)果報道，Snail,E12/E47等E-cadherin轉(zhuǎn)錄抑制子可以通過E-cadherin啟動子近端的E-box 相互作用而抑制E-cadherin的表達，而生物信息學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)巢蛋白 DNA序列中含有與Snail/Slug高度親和的E-box序列，因此E-cadherin和巢蛋白可能通過共同的信號通路開啟EMT，增加腫瘤的遷移能力，促進新生血管的生成，增加鼻咽癌的侵襲力，參與鼻咽癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，影響鼻咽癌的進展[19-20]。

Ki67是反映惡性腫瘤細胞增殖活性的一項重要指標，P53是反映惡性腫瘤預(yù)后的一項重要指標，Ki67和P53的表達越高就意味著腫瘤有著更差的預(yù)后[21]。本研究結(jié)果顯示Ki67和P53在鼻咽癌組織的陽性表達均高于鼻咽炎組織，與巢蛋白的表達一致，即Ki67、P53和巢蛋白高表達的鼻咽癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高風(fēng)險，預(yù)示著該腫瘤有較差的預(yù)后。因此綜合檢測巢蛋白、Ki67和P53對于預(yù)測鼻咽癌的生物學(xué)行為有一定意義。

綜上所述，免疫組織化學(xué)聯(lián)合檢測E-cadherin、 巢蛋白及腫瘤預(yù)后指標Ki67和P53，有利于預(yù)測鼻咽癌患者轉(zhuǎn)移風(fēng)險，為尋找新的分子靶向治療靶點提供新線索。

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(本文編輯：楊江瑜)

Expression and clinical significance of E-cadherin and Nestin in nasopharyngeal carcinoma

LiChuan，WangBing，YangJianxu，AnJing.

DepartmentofPathology,ZhengzhouPeople’sHospital,Zhengzhou450000，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of E-cadherin,Nestin,Ki67 and P53 in nasopharyngeal carcinoma. MethodsThe expression E-cadherin, Nestin, Ki67 and P53 in nasopharyngeal carcinoma (nasopharyngeal carcinoma group) and nasopharyngitis tissues (control group) were detected by immunohistochemical staining. The relationship between E-cadherin and Nestin and clinicopathological parameters was analyzed. ResultsThe positive rate of E-cadherin and Nestin expression in nasopharyngeal carcinoma group were 11.63% and 69.77% , significantly differing from 85.72% and 9.52% in the control group (both P<0.05). The positive rate of Ki63 and P53 in the nasopharyngeal carcinoma group was 93.02% and 88.37%, significantly higher compared with 9.52% and 4.76% in the control group (both P<0.05). The positive rate of E-cadherin expression was 3.33% and 30.77% in patients with and without lymph node metastasis, and the Nestin expression were 90.00% and 23.08% for the Nestin expression with statistical significance (all P<0.05). The expression of E-cadherin and Nestin was not correlated with alternative pathological parameters (both P>0.05).The expression of E-cadherin was negatively associated with Nestin expression(P<0.01). ConclusionThe expression of E-cadherin and Nestin was correlated with the lymph node metastasis of nasopharyngeal carcinoma, which probably together affects the metastasis of nasopharyngeal carcinoma.

【Key words】E-cadherin; Nestin; Nasopharyngeal carcinoma; Immunohistochemistry

(收稿日期：2015-11-06)

Corresponding author，An Jing，E-mail: anjing77@gmail.com

通訊作者，安靚，E-mail: anjing77@gmail.com

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.02.013

·臨床研究論著·