魏麗夏，任青，王金慎，趙麗麗，張勇軍(聊城市人民醫(yī)院，山東聊城 252000)

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高壓氧與神經(jīng)生長因子聯(lián)合應(yīng)用對HIBD新生大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和感覺運動功能的影響

魏麗夏，任青，王金慎，趙麗麗，張勇軍(聊城市人民醫(yī)院，山東聊城 252000)

摘要：目的觀察高壓氧(HBO)與神經(jīng)生長因子(NGF)聯(lián)合應(yīng)用對缺氧缺血性腦損傷(HIBD)新生大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和感覺運動功能的影響。方法 40只SD大鼠隨機分為5組各8只，A、B、C、D組大鼠均制備HIBD模型，制模后A組采用HBO聯(lián)合NGF治療，B組采用HBO治療，C組采用NGF治療，D組不干預(yù)；E組大鼠右側(cè)頸總動脈只分離而不結(jié)扎，術(shù)后不給予缺氧，不干預(yù)治療。各組大鼠生后30 d進行Morris水迷宮測試，比較兩組連續(xù)5 d逃避潛伏期及穿環(huán)指數(shù)；生后42 d進行感覺運動功能測試，比較兩組足錯誤次數(shù)左右差值、肢體放置左右差值。結(jié)果與E組比較，A組和C組第1、3、4、5天逃避潛伏期長，B組第1、5天逃避潛伏期長，D組第1～5天逃避潛伏期長；與D組比較，A、B、C、E組穿環(huán)次數(shù)多；與E組比較，A、B、C、D組肢體放置左右差值大；與D組比較，A、B、C、E組足錯誤次數(shù)左右差值小，肢體放置左右差值??；P均<0.05。結(jié)論 HBO與NGF聯(lián)合應(yīng)用可改善HIBD新生大鼠學(xué)習(xí)記憶力和感覺運動功能。

關(guān)鍵詞：高壓氧；神經(jīng)生長因子；缺氧缺血性腦損傷；學(xué)習(xí)記憶能力；感覺運動功能

新生兒缺氧缺血性腦損傷(HIBD)遠(yuǎn)期可引起智力障礙、癲癇、運動缺陷和認(rèn)知、學(xué)習(xí)障礙，而新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)是指由于圍生期缺氧窒息所導(dǎo)致的HIB，是新生兒期死亡和致殘的主要原因。高壓氧(HBO)療法是指機體處于高氣壓環(huán)境中，呼吸與環(huán)境等壓的高壓純氧或高壓混合氧，從而達(dá)到治療疾病的目的。神經(jīng)生長因子(NGF)是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，不僅對正常神經(jīng)細(xì)胞有營養(yǎng)保護作用，還能促進損傷神經(jīng)元再生和功能恢復(fù)，改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)。本研究觀察了HBO與NGF聯(lián)合應(yīng)用對HIBD新生大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和感覺運動功能的影響，旨在為兩者的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物、主要儀器及試劑健康7日齡SD大鼠40只，體質(zhì)量(14.5±3.2)g，雌雄不限。RSS-5100便攜式數(shù)字測氧儀(上海隆拓儀器設(shè)備有限公司)，YLC0.5/1A嬰兒高壓氧艙(中國船舶工業(yè)總公司第701研究所)，Morris水迷宮(MT-200，成都泰盟科技有限公司)，Recombinant Rat β-NGF(R&D公司)，氮氧混合氣(貴陽申建氣體有限公司)。

1.2實驗動物分組、HIBD模型制備及HBO、NGF干預(yù)40只SD大鼠隨機分為5組各8只。A、B、C、D組大鼠均制備HIBD模型[1]，即首先將大鼠以仰臥位固定于手術(shù)板上，頸部常規(guī)消毒，正中切口，長約0.3 cm，血管鉗輕柔分離右側(cè)頸總動脈，用0號無菌線雙線結(jié)扎，無菌手術(shù)刀剪斷下中，然后用無菌一次性縫線縫合切口。缺血術(shù)后將大鼠置于8%低氧環(huán)境(自制的新生大鼠缺氧裝置)，將8%O2+92%N2以1～2 L/min的速度輸入缺氧裝置，2 h后大鼠從缺氧裝置中取出，缺血缺氧后返回母鼠身邊繼續(xù)哺乳喂養(yǎng)。A組大鼠腦缺氧缺血術(shù)后30 min內(nèi)先腹腔注射0.5 μg的NGF，連續(xù)3 d；后采用HBO治療，1次/d，共7 d。B組大鼠腦缺氧缺血術(shù)后15～30 min采用HBO治療，1次/d，共7 d。C組大鼠腦缺氧缺血術(shù)后30 min內(nèi)腹腔注射0.5 μg的NGF，連續(xù)3 d。D組腦缺氧缺血后，正常飼養(yǎng)，不干預(yù)。E組大鼠右側(cè)頸總動脈只分離而不結(jié)扎，術(shù)后不給予缺氧，不干預(yù)治療。

1.3大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測試各組大鼠于出生后第30天進行Morris水迷宮實驗，包括定位航行實驗和空間搜索實驗。①定位航行實驗：主要通過測試逃避潛伏期(大鼠尋找并爬上平臺的路線圖和所需時間)來判斷大鼠水迷宮學(xué)習(xí)和記憶能力。實驗開始前1 d先將大鼠放入水池中(不放平臺)自由游泳2 min，使其熟悉迷宮環(huán)境。正式實驗共進行5 d，每天分上午和下午兩個時間段，每段時間訓(xùn)練4次，分別從4個不同的入水點入水。實驗記錄其大鼠逃避潛伏期，如果實驗大鼠在120 s內(nèi)未找到平臺，則需將其拿上平臺，記錄逃避潛伏期為120 s，每次訓(xùn)練時間間隔60 s。②空間搜索實驗：用于檢測大鼠學(xué)會尋找平臺后，對平臺空間位置記憶的保持能力。第6天撤除原平臺，將大鼠任選1個入水點放入水中，所有大鼠必須為同一入水點，記錄大鼠在2 min內(nèi)跨越原平臺的次數(shù)，稱為穿環(huán)指數(shù)。

1.4大鼠感覺運動功能測試各組大鼠于出生后第42天進行感覺運動功能測試，包括足錯誤實驗和肢體放置實驗。①足錯誤實驗：將大鼠放在水平的金屬網(wǎng)格上(50 cm×40 cm，每格3 cm×3 cm，金屬絲直徑0.4 cm)，記錄2 min內(nèi)大鼠前、后爪掉下來的次數(shù)。因不同大鼠活動度有個體差異，只記錄左右側(cè)錯誤次數(shù)的差值。②肢體放置實驗：記錄大鼠在不同的感覺刺激下左右側(cè)前后爪的放置情況，計分標(biāo)準(zhǔn)：爪子放置正確、迅速計0分，遲緩或不完全正確計1分，未放置計2分，記錄每只大鼠兩側(cè)得分的差值。

2結(jié)果

2.1各組逃避潛伏期、穿環(huán)指數(shù)比較連續(xù)5 d逃避潛伏期、穿環(huán)指數(shù)比較見表1。

表1　各組連續(xù)5 d逃避潛伏期、穿環(huán)指數(shù)比較±s)

注：與E組比較，*P<0.05，△P<0.01；與D組比較，﹟P<0.01。2.2各組足錯誤次數(shù)左右差值、肢體放置左右差值比較足錯誤次數(shù)左右差值、肢體放置左右差值比較見表2。

3討論

新生兒HIBD是由于圍產(chǎn)期窒息而導(dǎo)致的缺氧缺血性腦損害，目前治療以對癥支持治療為主，但迄今仍無有效治療措施來減輕HIBD后遺癥[2]。中重度HIBD患兒有很高的病死率，存活者可能遺留嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如腦癱、認(rèn)知障礙、學(xué)習(xí)障礙、癲癇等[3～6]。

表2　各組足錯誤次數(shù)左右差值、肢體放置左右差值比較

注：與E組比較，*P<0.05，△P<0.01；與D組比較，﹟P<0.01。

HBO療法是指機體處于高氣壓環(huán)境中，呼吸與環(huán)境等壓的高壓純氧或高壓混合氧，從而達(dá)到治療疾病的目的。研究[7,8]認(rèn)為，HBO對HIBD腦組織有保護。然而，HBO在腦損傷中的應(yīng)用及應(yīng)用效果一直存在爭議。有研究[9]證明，新生大鼠HIBD缺氧缺血后6 h內(nèi)進行HBO治療為最佳時間窗，缺氧缺血后12 h進行HBO治療反而會加重病情[10]。劉麗旭等[11]利用新生大鼠制備HIBD模型，發(fā)現(xiàn)選擇2ATA壓力、穩(wěn)壓時間為30～60 min的HBO治療大鼠腦損傷效果最佳，過高的HBO壓力反而加重腦組織損傷。

NGF是發(fā)現(xiàn)最早的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，是由118個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。NGF不僅對正常神經(jīng)細(xì)胞有營養(yǎng)保護作用，還能促進損傷神經(jīng)元再生和功能恢復(fù)，改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)[12]，保護和修復(fù)缺氧缺血后受損神經(jīng)[13]。在胚胎時期，NGF分布廣、含量多，為效應(yīng)神經(jīng)元生存所必須。出生后，NGF分布區(qū)域逐漸減少、含量下降。NGF在神經(jīng)損傷后可應(yīng)激性上調(diào)表達(dá)，但這種表達(dá)時間短、NGF含量較低，不足以全面而持久保護受損神經(jīng)[14]。因此，外源性NGF的供給是十分必要的。國內(nèi)外研究證明，在新生動物發(fā)生HIBD時，NGF是可以通過血腦屏障的，此為外源性NGF治療新生兒HIBD提供了可能理論。

學(xué)習(xí)記憶是大腦最重要的高級神經(jīng)活動之一，是中樞神經(jīng)功能的整合，學(xué)習(xí)和記憶是兩個不同又相關(guān)聯(lián)的神經(jīng)生物過程。水迷宮行為測定實驗是判定動物空間學(xué)習(xí)記憶的傳統(tǒng)經(jīng)典方法。30日齡大鼠的腦發(fā)育水平與人類幼兒期腦發(fā)育水平相當(dāng)，是智能發(fā)育的關(guān)鍵期，故選用此時間點研究學(xué)習(xí)記憶能力。感覺運動功能結(jié)果受個體差異因素影響，本實驗采用足錯誤和肢體放置實驗兩項測試提高研究的準(zhǔn)確性。本研究顯示，A組和C組第1天、第3天、第4天、第5天逃避潛伏期較E組長，B組第1天、第5天逃避潛伏期較E組長，D組第1～5天逃避潛伏期較E組長；A、B、C、E組穿環(huán)次數(shù)較D組多；A、B、C、D組肢體放置左右差值較E組大；A、B、C、E組足錯誤次數(shù)左右差值較D組小，肢體放置左右差值較D組小。提示HBO與NGF聯(lián)合應(yīng)用能夠改善HIBD新生大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和感覺運動功能。

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(收稿日期:2015-09-07)

中圖分類號：R722.1

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)03-0025-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.009