蔡沈陽，潘武，馮璽，葉輝

(四川大學(xué)華西醫(yī)院，成都610041)

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JNK信號通路對肝癌小鼠PGE2及CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)的影響

蔡沈陽，潘武，馮璽，葉輝

(四川大學(xué)華西醫(yī)院，成都610041)

摘要：目的探討c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路對肝癌小鼠PGE2以及CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)的影響。方法 BALB/c小鼠肝癌移植瘤模型分為實驗組與對照組，分別用SP600125多肽和生理鹽水處理24 d，RT-PCR法檢測各組JNK，ELISA法檢測PGE2，流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化法分別檢測小鼠外周血和肝癌組織中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。結(jié)果實驗組JNK表達(dá)低于對照組(0.68±0.03 比0.98±0.17,P<0.05)。實驗組組織中PGE2的表達(dá)低于對照組[(4.64±0.36)ng/g 比(6.64±1.24)ng/g，P<0.05)]；實驗組外周血PGE2的表達(dá)低于對照組[(76.57±10.16)pg/mL比(107.88±16.13)pg/mL),P<0.05]；在肝癌組織中，實驗組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所占百分比低于對照組[(14.37±3.35)% 比(30.90±4.19)%，P<0.05]；在外周血中，實驗組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所占百分比低于對照組[(3.20±0.12)% 比(4.22±0.32)%)，P<0.01]。 結(jié)論 阻斷肝癌小鼠JNK信號通路可使PGE2表達(dá)下降，進而引起CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平降低。

關(guān)鍵詞：肝腫瘤；c-Jun氨基末端激酶；前列腺素E2；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是能夠抑制T細(xì)胞增殖并同時抑制T細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)的細(xì)胞群，其主動參與免疫應(yīng)答及免疫耐受的調(diào)控，從而直接影響到自身免疫耐受、腫瘤免疫和移植免疫。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌以及其他多種腫瘤包括頭頸部腫瘤、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、惡性黑素瘤、腎癌及胰腺癌等CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平較正常人高[1~6]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中環(huán)氧酶2(COX-2)的含量與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平有一定相關(guān)性[7~9]。COX-2對腫瘤細(xì)胞的作用是通過其催化合成PGE2實現(xiàn)的[10]。肝癌等腫瘤細(xì)胞可誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤來源的PGE2并由此上調(diào)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的水平，從而產(chǎn)生腫瘤對機體的免疫抑制作用[7~10]。c-Jun氨基末端激酶(JNK)則是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑中最為重要的信號通路。許多研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中有JNK的過度激活, 提示JNK信號通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展可能有密切關(guān)系[11~13]。 JNK信號通路對于細(xì)胞的遷移、增殖、分化、死亡等過程極為重要，由其介導(dǎo)的細(xì)胞死亡和補償性增殖在肝癌的發(fā)生中有極重要的作用。本研究旨在探討在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，JNK信號通路能否通過調(diào)節(jié)機體PGE2的表達(dá)而改變CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平。

1材料與方法

1.1材料動物及細(xì)胞株：6~8周齡雌性BALB/c小鼠，SPF級，體質(zhì)量15~20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。BALB/c小鼠在四川大學(xué)國家重點實驗室動物房飼養(yǎng)。小鼠肝癌H22細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。主要試劑：sp600125多肽購自美國MedChemExpress公司；兔抗小鼠叉頭蛋白3-T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子抗體(Anti-Foxp3)購自加拿大PLlabs公司；FITC Rat Anti-mouse CD4抗體購自美國eBioscince公司；PE Anti-mouse CD25 抗體購自美國eBioscince公司。

1.2肝癌小鼠皮下移植瘤模型制備及分組將H22小鼠肝癌細(xì)胞裝于5 mL的培養(yǎng)瓶中，計數(shù)并調(diào)整水平至5×107/mL，用無菌注射器抽取并按107/0.2 mL/只注入BALB/c小鼠腹腔(4只)內(nèi)，使H22小鼠肝癌細(xì)胞在BALB/c小鼠腹腔內(nèi)繼續(xù)傳代培養(yǎng)。9~11 d后將小鼠脫臼處死，酒精棉擦拭小鼠腹部，無菌解剖剪剪開腹部皮膚暴露腹壁肌肉，無菌鑷子挑起腹壁，用2 mL無菌空針刺入腹腔，抽取腹水，用1640培養(yǎng)基稀釋至107/mL，取12只BALB/c小鼠，酒精棉擦拭項背部皮膚，用1 mL空針抽取細(xì)胞，按2×106/0.2 mL/只接種于小鼠項背部皮下。小鼠4周后均存活，各組小鼠毛色光澤度、飲食、活動以及大小便均正常。處死后解剖檢視均成瘤，皮下移植瘤呈圓形或類圓形。12只小鼠進行數(shù)字編號，隨機平均分為實驗組及對照組，實驗組小鼠按30 mg/kg每日給予SP600125多肽腹腔內(nèi)注射；對照組小鼠每日給予相同劑量PBS溶液作為對照。共處理24 d。

1.3血液中PGE2、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測所有小鼠于第24天通過摘除眼球采血，分別用生化管和裝有EDTA-K2抗凝劑采血管收集血液。生化管于3 000 r/min下離心15 min，取上清液置于液氮罐保存，抗凝血置于18~25 ℃保存。①PGE2的檢測：采用ELISA法。均按試劑盒步驟進行操作。②CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比的測算：采用流式細(xì)胞術(shù)。每個標(biāo)本取100 μL加EDTA抗凝血，離心棄去上清液，按1∶8加入紅細(xì)胞裂解液(1 mL細(xì)胞壓積加入8 mL紅細(xì)胞裂解液)，輕輕吹打均勻，室溫避光靜置10 min，1 000 r/min離心5 min，棄去上層紅色清液，收集沉淀部分，加入1 mL PBS緩沖液洗滌，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加0.5 mL PBS重懸，加入FITC Rat Anti-mouse CD4 抗體和PE Anti-mouse CD25 抗體，混勻，避光靜置約20 min，上流式細(xì)胞儀檢測。兩個均為陽性的即為CD4+CD25+細(xì)胞。計算CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例。

1.4肝癌組織中PGE2、JNK mRNA及CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測所有小鼠完整剝離腫瘤組織，將每只小鼠腫瘤組織分為3部分，一部分裝入2 mL EP管，置入液氮罐中保存；一部分裝入2 mL EP管中，加入1 mL TRIzol后放入液氮罐中保存；另一部分組織用多聚甲醛固定。Foxp3是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性、標(biāo)志性分子，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Foxp3+細(xì)胞相關(guān)性接近100%，因此可作為CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測標(biāo)志。①PGE2的檢測：采用ELISA法。組織先研磨制成組織勻漿，然后3 500 r/min離心15 min，保留上清液。按試劑盒說明進行操作。②JNK mRNA的檢測：采用RT-PCR法。提取總RNA保存于-80 ℃冰箱中。參照基因庫基因序列設(shè)計引物，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。JNK引物片段長度為161 bp：正義鏈：5′-CTCTCCAGCACCCGTACATCAA-3′；反義鏈：5′-CTTAGTTCGCTCCTCCAAATCCA-3′。按Promega公司生產(chǎn)的RT-PCR試劑盒說明書進行操作。③Foxp3的檢測：采用免疫組化法。取用多聚甲醛固定的組織標(biāo)本，石蠟包埋，切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟、入水，采用枸櫞酸緩沖液(0.01 mol/L，pH 6.0)微波爐抗原熱修復(fù)，加正常山羊血清封閉液室溫避光孵育20 min。Foxp3檢測采用SABC法，即加入一抗孵育后，PBS緩沖液清洗5 min×3次；滴加生物素化第二抗體(IgG)，37 ℃孵育30 min，PBS緩沖液清洗5 min×3次；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，PBS緩沖液清洗5 min×3次；用DAB顯色試劑盒顯色，蒸餾水洗；蘇木素復(fù)染、鹽酸乙醇分化；脫水、透明、封片、鏡檢。陽性結(jié)果判斷：在高倍鏡視野下隨機觀察 5 個視野，F(xiàn)oxp3陽性染色以細(xì)胞核染成棕黃色為主，計數(shù)腫瘤組織中Foxp3陽性細(xì)胞數(shù)及淋巴細(xì)胞數(shù)，計算Foxp3陽性細(xì)胞(CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)占淋巴細(xì)胞比例(%)。

2結(jié)果

2.1兩組JNK mRNA、PGE2水平比較見表1。

表1　兩組JNK mRNA、PGE2水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2兩組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平比較實驗組外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例為(3.20±0.12)%，對照組為(4.22±0.32)%，兩組比較，P<0.05。在小鼠肝癌組織中，實驗組Foxp3陽性細(xì)胞(CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)占腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的比例為(14.37±3.35)%，對照組為(30.90±4.19)%，兩組比較，P<0.01。如圖1所示。

注：A圖為實驗組，B圖為對照組(SABC ×400)。

圖1阻斷JNK信號通路對小鼠肝癌組織

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響

3討論

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是目前發(fā)現(xiàn)的最為重要的免疫抑制細(xì)胞，具有免疫抑制性和免疫無能性，在自身免疫性疾病、腫瘤的免疫以及移植耐受等方面具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者無論是外周血還是腫瘤組織中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例顯著高于正常人。Yang等[14]通過測量肝癌腫瘤組織和癌旁正常組織CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平較癌旁正常組織明顯升高。徐大恒等[7]對肝癌小鼠移植瘤模型的研究發(fā)現(xiàn)，移植瘤大小與肝癌組織以及外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平密切相關(guān)。這些研究結(jié)果提示肝癌患者機體中因CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增高而導(dǎo)致不同程度的免疫抑制，致使腫瘤組織進展性生長。

抑制機體CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)成為近年肝癌免疫治療關(guān)注的熱點。研究表明，PGE2既可以誘導(dǎo)CD4+CD25-轉(zhuǎn)變?yōu)镃D4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞并促進其表達(dá)特征標(biāo)記Foxp3，還可以增強CD4+CD25+T細(xì)胞的免疫抑制作用[15]。因而，抑制PGE2的產(chǎn)生，可以有效抑制CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成以及功能表達(dá)。有研究者使用選擇性COX-2抑制劑抑制機體PGE2的產(chǎn)生，致使肝癌小鼠無論是外周血還是腫瘤組織中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)顯著降低[7]。

PGE2是由COX-2催化合成的，不同的刺激因素誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)COX-2 的途徑不同。細(xì)胞應(yīng)激和致炎因子通常經(jīng)過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑增加內(nèi)皮細(xì)胞 COX-2 mRNA的穩(wěn)定性從而上調(diào)COX-2 的表達(dá)[16]。JNK信號通路是MAPK途徑中最為重要的一種， 許多研究發(fā)現(xiàn)JNK信號通路在腫瘤細(xì)胞中過度激活，與許多腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。

本研究通過阻斷肝癌小鼠JNK信號通路后發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中以及外周血中PGE2的表達(dá)均下降，并且CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例顯著降低。推測JNK信號通路可能通過PGE2來調(diào)節(jié)機體CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)。

肝癌以手術(shù)為主的綜合治療效果至今仍不滿意，免疫治療有可能成為一個新的治療手段。目前的免疫治療是應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑非特異性地增強機體的免疫功能，激活機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，但是收效甚微。本實驗對小鼠肝癌的研究發(fā)現(xiàn)，阻斷JNK信號通路可抑制CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在機體中的表達(dá)，使小鼠肝癌的生長受到抑制，這可能為肝癌免疫治療提供新的靶點。

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Effects of JNK signaling pathway on expression of CD4+CD25+regulatory T cells and PGE2in mice with liver cancer

CAIShenyang,PANWu,FENGXi,YEHui

(WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of c-Jun N-terminal kinases (JNK) signaling pathway on PGE2and CD4+CD25+T regulatory T cells expression of mice with liver cancer. MethodsThe liver cancer xenograft models of BALB/c mice were divided into the experimental group and control group. Mice in each group were treated with SP600125 polypeptides or normal saline respectively for 24 days. RT-PCR was used to detect the expression of JNK pathway signal, ELISA was used to detect the PGE2levels, and flow cytometry and immunohistochemistry were used respectively to detect CD4+CD25+T regulatory T cells levels in the peripheral blood and liver cancer tissues. ResultsThe expression of JNK signaling pathway in the experimental group was lower than that of the control group [(0.68±0.03) vs. (0.98±0.169), P<0.05]. The level of PGE2was lower in the experimental group as compared with that of the control group [(4.64±0.36) ng/g vs. (6.64±1.24) ng/g, P<0.05]. In the periphery blood, PGE2level of the experimental group was lower than that of the control group [(76.57±10.16) pg/ml vs. (107.88±16.13) pg/ml, P<0.05]. In the liver cancer tissues, the percentage of CD4+CD25+T regulatory T cells of the experimental group was decreased as compared with that of the control group [(14.37±3.35)% vs. (30.90±4.19)%, P<0.01]. In the peripheral blood, the percentage of CD4+CD25+T regulatory T cells of the experimental group was lower than that of the control group [(3.20±0.12)% vs. (4.22±0.32)%, P<0.05]. ConclusionWhen JNK signaling pathway was blocked, the expression level was down-regulated, and consequently the levels of CD4+CD25+T regulatory T cells decreased.

Key words:liver neoplasms; c-Jun N-terminal kinases; prostaglandins E2; regulatory T cells

(收稿日期：2015-09-19)

中圖分類號：R735.7

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)01-0005-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.01.002

通信作者簡介：葉輝(1963-)，男，教授，主要研究方向為肝膽胰疾病的基礎(chǔ)研究與臨床診治。E-mail：doctor1880@163.com

作者簡介：第一蔡沈陽(1990-)，男，博士，主要研究方向為肝膽胰疾病的基礎(chǔ)研究與臨床診治。E-mail：cai1179@126.com

基金項目：四川省科技支撐計劃項目(2013FZ0012)。