何 文，胡翠萍，郭咸希

（1．武漢大學人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060； 2．武漢大學藥學院，湖北 武漢 430071）

水飛薊賓脂質(zhì)體制備方法研究

何 文1，胡翠萍2，郭咸希1

（1．武漢大學人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060； 2．武漢大學藥學院，湖北 武漢 430071）

目的 建立水飛薊賓脂質(zhì)體的最佳制備方法。方法 分別采用薄膜分散法、復乳法、逆向蒸發(fā)法制備水飛薊賓脂質(zhì)體；采用光學顯微鏡觀察脂質(zhì)體的形態(tài)；采用濾膜法分離水飛薊賓脂質(zhì)體中游離的藥物，高效液相色譜法測定脂質(zhì)體的藥物含量，計算包封率，并以包封率和粒徑分布為主要考察指標篩選最佳制備方法。結果 3種方法制備的脂質(zhì)體形態(tài)圓整，基本無區(qū)別；采用薄膜分散法、復乳法、逆向蒸發(fā)法制備的脂質(zhì)體在高速剪切前包封率分別為(88．67±16)%，(68．88±1．5)%和(59．96±1．2)%，高速剪切后包封率分別為(72．32±7．6)%，(31．68±3．1)%和(37．66±1．4)%，剪切后平均粒徑分別為（134．8±2．5）nm，（138．5±2．5）nm和（165．0±1．1）nm，多分散性指數(shù)分別為0．235，0．182和0．233。結論 薄膜分散法制備水飛薊賓脂質(zhì)體包封率較高，減小粒徑后對包封率的影響也較小，為后續(xù)制備肝靶向制劑奠定了試驗基礎。

水飛薊賓；脂質(zhì)體；包封率；多分散性指數(shù)

水飛薊賓（SLB）是從菊科藥用植物水飛薊種子的種皮中提取所得的黃酮類化合物，有明顯的保護和穩(wěn)定肝細胞、改善肝功能的作用[1]。其藥理作用包括抗肝纖維化、抗脂質(zhì)過氧化、抗炎作用、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和調(diào)節(jié)血脂等[2]，已被廣泛應用于治療各種肝功能紊亂疾病，如肝硬化、肝炎和由酒精或毒素造成的脂肪肝等[3－4]。SLB是脂溶性物質(zhì)，口服生物利用度低[5]。研究表明，將其制成脂質(zhì)體、環(huán)糊精包合物、水溶性葡甲胺鹽、卵磷脂復合物、固體分散體等，可改善生物利用度[6]。制備SLB脂質(zhì)體的方法很多，如薄膜超聲分散法[7]、乙醇注入法[8]、前體脂質(zhì)體法[9]、逆向蒸發(fā)法[5]等。本試驗中擬采用不同方法制備SLB脂質(zhì)體，以其粒度分布和包封率為指標來選擇最佳制備方法，為后續(xù)研究新型肝靶向制劑奠定基礎。

1 儀器與試藥

SPD－20A型／LC－20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；FLUKO FA25型高速分散機（上海凡勁儀器設備有限公司）；Zetasizer 3000HS型激光粒度分析儀（英國Malvern公司）；SHB－Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；W2－100S型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司）；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；冷凍臺式離心機型（武漢赤城生物技術有限公司），C－SHG Hg 50W型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。SLB原料藥（西安飛達生物技術有限公司，批號為FD20140117，純度 98%）；SLB對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110856－201305，純度≥98%）；卵磷脂（國藥集團化學試劑有限公司，批號為Lot．NO20130724）；膽固醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號為20120627）；氯化鈉注射液（武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責任公司，批號為131113801）；甲醇為色譜純，氯仿、乙醇等試劑為分析純。

2 方法與結果

2．1 SLB含量測定

2．1．1 色譜條件[10]與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Agilent TC－C18柱(250 mm×4．6 mm，5 μm)；流動相：甲醇－水－冰醋酸 （54∶46∶0．5）；流速：0．8 mL／min；檢測波長：288 nm；柱溫：40℃；進樣體積：20 μL。在此色譜條件下，脂質(zhì)體輔料對測定無干擾，結果見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2．1．2 標準曲線繪制

精密稱取于真空干燥箱60℃干燥至恒重的SLB對照品10 mg，置50 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解，并用蒸餾水定容，搖勻，配制成 200 μg／mL的貯備液。分別精密量取貯備液 0．10，0．25，0．50，1．00，2．00，4．00 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇與水的混合溶劑定容，搖勻，稀釋得質(zhì)量濃度為 2，5，10，20，40，80 μg／mL的對照品溶液。用0．45 μm微孔濾膜過濾后，分別進樣20 μL，記錄峰面積，以峰面積 A對質(zhì)量濃度 C(μg／mL)進行線性回歸，得標準曲線方程A＝69 379 C＋21 315，r＝0．999 9(n＝6)。SLB質(zhì)量濃度線性范圍是2～80 μg／mL。

2．1．3 精密度試驗

精密吸取不同量的SLB貯備液，置10 mL容量瓶中，用甲醇與水的混合溶劑定容并配制成5，20，80 μg／mL的溶液，于1 d和5 d內(nèi)重復進樣5次。結果日內(nèi)精密度的 RSD分別為1．22%，0．97%和0．96%，日間精密度的 RSD分別為1．63%，1．18%和0．80%(n＝5)，表明方法精密度良好。

2．1．4 回收率試驗

依法制備空白納米脂質(zhì)體。分別吸取空白納米脂質(zhì)體溶液2 mL，置10 mL容量瓶中，精密加入不同量的SLB貯備液，再用適量甲醇破乳，并加蒸餾水定容搖勻，以3 000 r／min離心15 min，取上清液，經(jīng)0．45 μm微孔濾膜過濾后進樣分析，根據(jù)峰面積和標準曲線計算藥物濃度，與加入藥物濃度比較，計算平均回收率。結果見表1。

表1 SLB回收率試驗結果（n＝3）

2．2 SLB脂質(zhì)體制備方法

2．2．1 薄膜分散法

稱取卵磷脂20 mg，膽固醇2 mg，水飛薊賓1 mg，置500 mL茄形瓶中，加入15 mL氯仿與乙醇的混合溶劑充分溶解。于50℃水浴減壓蒸餾除去有機溶劑，形成均勻透明的薄膜，繼續(xù)抽真空除去殘余溶劑。加入10 mL生理鹽水水合介質(zhì)洗膜，于50℃恒溫水浴水化1 h，得到乳狀半透明脂質(zhì)體溶液，并高速剪切分散10 min，密封置冰箱4℃保存。

2．2．2 復乳法

稱取卵磷脂20 mg，膽固醇2 mg，水飛薊賓1 mg，置500 mL梨形瓶中，加入一定體積有機溶劑(體積比為2∶1的三氯甲烷／乙醇混合溶劑)溶解，再加入少量生理鹽水，將梨形瓶置100 W超聲波儀上超聲乳化5 min，形成的W／O型乳液呈乳白色。將梨形瓶置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，于50℃水浴進行減壓蒸餾，除去少量有機溶劑，再加入10 mL生理鹽水，此時形成W／O／W型復乳。溫度保持不變，壓力不變，繼續(xù)蒸餾除盡有機溶劑，形成的脂質(zhì)體為乳白色懸浮液，并高速剪切分散10 min，置4℃冰箱保存。

2．2．3 逆向蒸發(fā)法

稱取卵磷脂20 mg，膽固醇2 mg，水飛薊賓1 mg，置500 mL梨形瓶中，加入一定體積有機溶劑(體積比為2∶1的三氯甲烷／乙醇混合溶劑)溶解，再加10 mL生理鹽水水超聲5 min，將梨形瓶置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，減壓蒸餾，直至形成反膠束凝膠，維持真空，繼續(xù)減壓蒸餾至其塌陷形成脂質(zhì)體為乳白色懸浮液，并高速剪切分散10 min，置4℃冰箱保存。

2．3 形態(tài)觀察

分別取未剪切的一定體積的不同方法制備的SLB脂質(zhì)體，用蒸餾水稀釋到合適濃度，取適量置載玻片上，于光學顯微鏡下10×10倍觀察形態(tài)并照相。結果見圖2?？梢?，3種方法制備成的脂質(zhì)體在光學顯微鏡下均呈雙層膜，形態(tài)圓整，粒徑分布均勻。

圖2 SLB脂質(zhì)體的形態(tài)觀察

2．4 粒度分析

分別取一定體積的不同方法制備的SLB脂質(zhì)體，置10 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋定容并且混勻，再分別取適量放入樣品池中，用粒度分析儀進行測定。結果見表2和圖3。

表2 不同方法制備的SLB脂質(zhì)體的粒徑分布

2．5 包封率測定

圖3 SLB脂質(zhì)體的粒徑分布

采用透析法測定包封率[11]。取SLB脂質(zhì)體混懸液1 mL，置透析袋內(nèi)，兩端用透析夾夾緊后，置100 mL的0．5%吐溫80透析液中，室溫下磁力攪拌，透析8 h后，完全轉(zhuǎn)移透析袋內(nèi)的溶液于10 mL容量瓶中，甲醇定容，過0．45 μm微孔濾膜，上液相色譜儀測定藥物質(zhì)量濃度為 C1。另取未透析的脂質(zhì)體1 mL，置10 mL容量瓶中，甲醇定容，破乳至澄清透明，過0．45 μm微孔濾膜，測定藥物質(zhì)量濃度為 C2。包封率＝C1／C2×100%。將以上3種方法所制得的脂質(zhì)體依法測定并計算包封率，結果見表 3。用 SPSS軟件進行 t檢驗，薄膜分散法制備的脂質(zhì)體包封率在剪切前后差異無顯著性（P＞0．05），表明薄膜分散法剪切前后的包封率無明顯改變；而復乳法和逆向蒸發(fā)法制備的脂質(zhì)體包封率在剪切前后差異有顯著性（P＜0．05），即高速剪切對此兩種方法制備的脂質(zhì)體包封率影響較大。結果表明，應用薄膜分散法制備的脂質(zhì)體包封率較高，調(diào)整粒徑后對包封率的影響也較小。因此，選擇薄膜分散法制備 SLB脂質(zhì)體。

表3 包封率測定結果（±s，%，n＝3）

表3 包封率測定結果（±s，%，n＝3）

時間高速剪切前高速剪切后薄膜分散法88．67±1．6 72．32±7．6復乳法68．88±1．5 31．68±3．1逆向蒸發(fā)法59．96±1．2 37．66±1．4

2．6 磷脂氧化指數(shù)測定

取制備好的脂質(zhì)體適量，加無水乙醇定容至10 mL，分別測定在波長233 nm和215 nm的吸光度，按照公式計算氧化指數(shù)，氧化指數(shù)＝A233nm／A215nm。A233nm和 A215nm分別為溶液在波長233 nm和215 nm的吸光度。結果見表 4，表明 3批脂質(zhì)體的氧化指數(shù)均小于 0．2，符合2010年版《中國藥典(二部)》的要求。

表4 SLB脂質(zhì)體氧化指數(shù)測定結果（n＝3）

3 討論

樣品含量的計算：SLB以一對非對映異構體的形式存在，兩者具有類似的藥理作用[8]，在高效液相色譜分析中表現(xiàn)為雙峰，2010年版《中國藥典(二部)》規(guī)定其含量測定以兩峰面積之和定量。

流動相比例的確定：參照藥典和有關文獻[10]，最終將流動相調(diào)整為甲醇－水－冰醋酸（54∶46∶0．5）。調(diào)整過程中發(fā)現(xiàn)，加大冰醋酸的比例可抑制峰形拖尾，可能是因為SLB的化學結構中含有較多的羥基，可與色譜柱中的硅羥基（吸電子基團）產(chǎn)生作用力。酸性環(huán)境抑制了硅羥基的電離，使得硅羥基呈分子狀態(tài)，從而不易吸引 SLB中的羥基氫。因此，加大酸度可有效消除峰拖尾[12]。SLB是脂溶性物質(zhì)，當流動相中甲醇比例提高時，洗脫能力增強，使樣品能夠很快流出，但由于洗脫時間不夠，兩峰不能很好地分離；反之，當流動相中水的比例提高時，洗脫能力減弱，保留時間延長，兩峰分離較好，而水的比例過高則易出現(xiàn)峰拖尾，可能是因為洗脫時間過長。

包封率方法的確定：本試驗采用透析法測定包封率，配制的0．5%吐溫80水溶液（W／V）作為透析介質(zhì)，能使不溶于水的SLB充分溶解，起到了增溶效果?？疾炝瞬煌橘|(zhì)濃度（0．5%，1%，2%）對透析達到平衡時間的影響，發(fā)現(xiàn)使用不同濃度的介質(zhì)，在8 h均能達到平衡，最終選擇濃度為0．5%吐溫80水溶液作為透析介質(zhì)。

制備方法的確定：脂質(zhì)體的制備方法很多，本試驗中采用了薄膜分散法、復乳法、逆向蒸發(fā)法、乙醇注入法等方法。由于在制備過程中發(fā)現(xiàn)，本試驗中使用的磷脂和膽固醇微溶于乙醇，雖然通過光學顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)有少量脂質(zhì)體形成，但不穩(wěn)定，幾小時后就出現(xiàn)了沉淀，于是舍棄了這種方法。前3種方法都能制備成較穩(wěn)定的脂質(zhì)體，通過高速剪切機分散，有效地減小了粒徑，粒徑分布均勻，但包封率都出現(xiàn)不同程度地降低，可能是因為高速剪切過程中產(chǎn)生的能量高，導致脂質(zhì)體中藥物發(fā)生滲漏；薄膜分散法制備的多為大多層脂質(zhì)體（MLV），其他2種方法制備的多為大單室脂質(zhì)體（LUV）[13]，而MLV脂質(zhì)體層數(shù)多，受到高速剪切破壞的程度較小，因此包封率下降程度相對較小。試驗過程中還考察了薄膜分散法制備的脂質(zhì)體氧化指數(shù)，結果表明，脂質(zhì)體的氧化指數(shù)達到了藥典要求，為進一步體內(nèi)外試驗奠定了基礎。

綜上所述，應用薄膜分散法制備的脂質(zhì)體包封率較高，調(diào)整粒徑后對包封率的影響也較小，因此本試驗中將此方法用于制備SLB脂質(zhì)體，并進一步優(yōu)化了該方法的處方工藝，為后續(xù)研究奠定了基礎。

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Studies on the Preparation Methods of Silybin Liposomes

He Wen1,Hu Cuiping2,Guo Xianxi1

(1．Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan,Hubei,China 430060; 2．School of Pharmaceutical Science,Wuhan University,Wuhan,Hubei,China 430071)

Objective To screen the best method to prepare silybin liposomes．M ethods Silybin liposomes were respectively prepared by film dispersion method,multiple emulsion method,and reverse evaporation method．The morphological characteristic of the liposomes was observed by optical microscope．The filter membrane method was employed to isolate free silybin,and HPLC was used to determine the drug content and the entrapment efficiency of silybin liposomes．The entrapment efficiency and particle size distribution as the indices, the best prepareration method was chosen．Results Before high－speed shearing,the liposomes respectively prepared by the three methods are spheroidal without no difference．The entrapment efficiency of the liposomes respectively prepared by film dispersion method, multiple emulsion method and reverse evaporation method,was respectively(88．67±16)%,(68．88±1．5)% and(59．96±1．2)%; while the encapsulation efficiency was respectively (72．32±7．6)%,(31．68±3．1)% and (37．66±1．4)% after high－speed shearing．The mean diameter of silybin liposomes were(134．8±2．5)nm,(138．5±2．5)nm and (165．0±1．1)nm after high－speed shearing．The polydispersity indeice were 0．235,0．182 and 0．233,respectively．Conclusion The encapsulation efficiency of silybin liposomes prepared by the film dispersion method is the highest,and the effect of decreasing size on the entrapment efficiency is not evident, which can provide experimental foundation for the further study of the liver targeting preparation．

silybin;liposomes;encapsulation efficiency;polydispersity index

R944；TQ461

A

1006－4931(2016)01－0049－04

2015－06－27)