高彥令，劉長勝，趙　銳，王林林，李姍姍，劉　敏，張　淼，姜述堃，田志嶺，王　檬，官大威（.中國醫(yī)科大學法醫(yī)學院法醫(yī)病理學教研室，遼寧沈陽000；2.蘇州市公安局刑警支隊，江蘇蘇州25000；.鞍山市人民檢察院技術處，遼寧鞍山400）

?

小鼠皮膚損傷愈合過程中PI3K/Akt通路的作用

高彥令1，2，劉長勝3，趙銳1，王林林1，李姍姍1，劉敏1，張淼1，姜述堃1，田志嶺1，王檬1，官大威1
（1.中國醫(yī)科大學法醫(yī)學院法醫(yī)病理學教研室，遼寧沈陽110001；2.蘇州市公安局刑警支隊，江蘇蘇州215000；3.鞍山市人民檢察院技術處，遼寧鞍山114001）

摘要：目的探討小鼠皮膚損傷愈合過程中損傷區(qū)磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（phospho-PI3K，p-PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱Akt）和磷酸化蛋白激酶B（phospho-Akt，p-Akt）的表達及其隨時間的變化規(guī)律。方法應用免疫組織化學染色、Western印跡法和real-time PCR技術檢測小鼠皮膚損傷不同時間段PI3K、Akt、p-PI3K及p-Akt的變化情況。結果免疫組織化學染色顯示，皮膚損傷后，PI3K、p-Akt陽性染色出現在單核細胞和成纖維細胞，峰值出現在組織修復期。Western印跡法顯示，各個時間段均有PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的陽性條帶，其中p-PI3K、p-Akt表達的峰值出現在炎癥期和增生期，PI3K、Akt表達的高峰出現在組織重建期。real-time PCR結果顯示，PI3K mRNA的峰值出現在炎癥期和組織重建期，Akt mRNA的峰值出現在組織重建期。結論在皮膚損傷愈合過程中，PI3K、Akt、p-PI3K及p-Akt的表達變化呈現不同的規(guī)律性并有較好的時間依賴性，PI3K/Akt通路的表達規(guī)律可以用于法醫(yī)學損傷時間推斷。

關鍵詞：法醫(yī)病理學；創(chuàng)傷和損傷；皮膚；磷脂酰肌醇-3-激酶；磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶；蛋白激酶B；磷酸化蛋白激酶B；小鼠

皮膚損傷愈合過程包括炎癥期、增生期和組織重建期[1]。在這期間，中性粒細胞、單核細胞和成纖維細胞是重要的效應細胞，中性粒細胞和單核細胞發(fā)揮的是清除異物及壞死物質的作用，而成纖維細胞發(fā)揮的是組織修復的作用。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱Akt）是細胞內重要的信號傳導通路，參與細胞增殖、分化和凋亡等多種生物過程[2]。研究[3]表明，該信號通路在皮膚損傷愈合過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。本研究在建立小鼠不同時間皮膚損傷模型基礎上，應用免疫組織化學染色、Western印跡法和real-time PCR技術檢測PI3K、Akt、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（phospho-PI3K，p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（phospho-Akt，p-Akt）的表達及其隨時間的變化，探討PI3K/Akt通路應用于損傷時間推斷的可行性。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器

山羊抗小鼠p-PI3K多克隆抗體、兔抗小鼠p-Akt多克隆抗體（sc-12929、sc-101629）、小鼠抗β-actin單克隆抗體、兔抗山羊IgG、山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG、ECL發(fā)光液（美國Santa Cruz公司）。兔抗小鼠PI3K多克隆抗體、兔抗小鼠Akt多克隆抗體、小鼠源p-Akt單克隆抗體（美國Proteintech公司）。PV-9001兔超敏檢測試劑盒、DAB顯色劑（北京中杉金橋生物有限公司），6條帶預染Marker（加拿大Fermentas公司），Western印跡法及IP細胞裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）。PI3K、Akt、β-actin引物、RNA PCR試劑盒（日本Takara公司）。Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）。

DM3000顯微鏡（德國Leica公司），Tanon 5500全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司），7500 Real-Time PCR系統(tǒng)（美國AB公司）。

1.2動物模型制作及分組

健康成年清潔級昆明系雄性小鼠50只，體質量35~40g，隨機分為傷后1、3、5、7、9、11、13、17、21d組和對照組，每組5只。損傷動物模型于腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液（175mg/kg）麻醉，背部剃毛處理，碘伏消毒后，在背部中央、脊柱兩側對稱處用打孔器打2個內徑6mm皮膚全層厚的圓孔，創(chuàng)面自然止血，不包扎，不施藥。損傷后每只小鼠給予清潔飼料及蒸餾水，分籠飼養(yǎng)，并保持創(chuàng)面干燥，防止感染。分別于傷后1、3、5、7、9、11、13、17、21d腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液（350 mg/kg）處死小鼠，取損傷處皮膚組織1cm×1cm。對照組小鼠不做皮膚打孔，取相同部位同等大小皮膚。

1.3組織病理學檢驗

每組1/2皮膚組織放入4%多聚甲醛-PBS溶液中固定12h后，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制作5μm厚度連續(xù)切片。

1.3.1 HE染色

切片脫蠟，水化，蘇木素染色5min，在1%鹽酸-乙醇溶液中分化數秒，自來水中返藍30 min，1%伊紅染色3min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3.2免疫組織化學染色

切片脫蠟，水化，微波抗原修復后用3% H2O2孵育，分別用兔抗小鼠PI3K多克隆抗體（1∶300）和兔抗小鼠p-Akt多克隆抗體（1∶100）作為一抗，應用SP超敏二步法進行免疫組織化學染色，DAB顯色，蘇木素核復染。染色中以PBS代替一抗作為空白對照。

1.4 Western印跡法檢測

冰?。?℃）下將各時間段另1/2皮膚組織剪碎，加入組織裂解液300 μL，其中苯甲基磺酰氟（PMSF）濃度為1mmol/L，勻漿，超聲破碎后，4℃下以離心半徑9.35cm，12000r/min，離心15min，提取上清液，用BCA法測量蛋白濃度，將蛋白置于-80℃保存，備用。變性后，總蛋白量為30μg。10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后，濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上。TBST洗滌3次，用5%脫脂牛奶封閉2h，分別用山羊抗小鼠p-PI3K多克隆抗體（1∶100）、兔抗小鼠PI3K多克隆抗體（1∶800），兔抗小鼠Akt多克隆抗體（1∶600）、小鼠源p-Akt單克隆抗體（1∶2000）孵育，4℃過夜。TBST洗滌3次后，分別與山羊抗小鼠IgG二抗（1∶5 000）、山羊抗兔IgG二抗（1∶5000）、山羊抗小鼠IgG（1∶5000）室溫孵育2h，TBST洗滌3次，ECL發(fā)光。

1.5 real-time PCR技術檢測

冰上取各組小鼠損傷區(qū)皮膚，按試劑盒說明書進行總mRNA提取，然后以逆轉錄法先合成cDNA，再進行real-time PCR檢測。用Primer Express 5軟件查找PI3K、β-actin引物，Akt引物按照文獻[4]進行合成，引物序列見表1。應用PRISM?7500 Real-Time PCR系統(tǒng)進行擴增。20 μL反應體系組成：SYBR? Premix Ex Taq（2×）10μL，ROX DyeⅡ0.4μL，去離子水6μL，PCR上游引物0.8μL，PCR下游引物0.8μL，cDNA 2 μL。兩步法PCR擴增標準程序：95℃30 s，1個循環(huán)；95℃5s，60℃34s，40個循環(huán)；95℃15s，60℃30s，95℃15s，1個循環(huán)。采集熒光信號，繪制溶解曲線。

表1 real-time PCR引物序列

1.6結果分析

1.6.1免疫組織化學染色

PI3K、p-Akt陽性表達位于胞質及胞核，用DAB顯色呈棕黃色。顯微鏡（×400）下，在每張切片損傷及其周邊區(qū)（距損傷區(qū)200μm范圍內）隨機選擇10個視野，計算多核粒細胞、單核細胞及成纖維細胞的陽性細胞數及與三種細胞總數的比值（陽性細胞率）。應用Image pro plus 6.0圖像分析軟件計算所選視野的積分光密度（IOD）。

1.6.2 Western印跡法

應用Tanon 5500全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進行譜帶分析和光密度值測定。

1.6.3 real-time PCR技術

real-time PCR結果由PRISM?7500 Real-Time PCR系統(tǒng)自動采集給出PI3K、Akt基因的相對含量。

1.7統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0軟件，應用方差分析對數據進行統(tǒng)計學處理，組間比較用t檢驗，數據應用x±s表示，檢驗水準α=0.05。

2結　果

2.1 HE染色

傷后1d，損傷區(qū)內可見大量炎癥細胞浸潤，以多核粒細胞和單核細胞為主；傷后3d，肉芽組織形成，中性粒細胞明顯減少，可見大量單核細胞和成纖維細胞；傷后7d，肉芽組織內可見大量長梭形細胞核管腔樣結構；傷后11~13d，損傷基本愈合，損傷及其周邊區(qū)內中性粒細胞、單核細胞及成纖維細胞逐漸減少，間質增多，肉芽組織向瘢痕組織轉變；傷后21d，損傷完全愈合，細胞排列緊密，與13d相比，無明顯變化。

2.2免疫組織化學染色及陽性細胞率、積分光密度值

對照組小鼠皮膚組織內，表皮、毛囊、皮脂腺、皮肌層表達PI3K、p-Akt。

傷后1d，PI3K主要表達于多核粒細胞和部分單核細胞；3~5 d，單核細胞逐漸增多，成纖維細胞開始出現，其陽性染色集中于單核細胞及成纖維細胞，并于5d陽性細胞率達到高峰；7~11d，PI3K陽性染色以成纖維細胞為主，積分光密度值達到峰值；13~21 d，損傷愈合，損傷及其周邊區(qū)成纖維細胞逐漸減少，以瘢痕組織代替（圖1，表2）。

傷后1 d，p-Akt主要表達于多核粒細胞和部分單核細胞；3~5d，其陽性染色集中于單核細胞和成纖維細胞，陽性細胞率逐漸升高；7~11 d，p-Akt陽性染色以成纖維細胞為主，并于7d陽性細胞率達到高峰；13~21 d，損傷愈合，p-Akt積分光密度值降低（圖2，表2）。

2.3 Western印跡法

以β-actin（相對分子質量4.3×104）為內參，PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt在對照組及各損傷組均有陽性條帶，分別位于1.26×105、8.5×104、6.2×104、6.6×104處，且表達強度具有一定規(guī)律。傷后1d，PI3K表達強度略有下降；3~11 d，表達逐漸增強，并于11 d達到峰值；隨后表達逐漸減弱。傷后1~3d，p-PI3K表達強度逐漸增強，3 d達到峰值；隨后表達逐漸減弱。傷后1d，Akt蛋白表達略有下降；3~13d，表達逐漸升高，在13d達到峰值；隨后表達逐漸降低。傷后1d，p-Akt蛋白表達達到峰值；隨后表達逐漸降低（表3，圖3~4）。

表2小鼠皮膚損傷后各時間段PI3K、p－Akt的陽性細胞率和積分光密度值　　（n=5，±s）

表2小鼠皮膚損傷后各時間段PI3K、p－Akt的陽性細胞率和積分光密度值　?。╪=5，±s）

注：1）與相鄰上組比較，P＜0.05；2）與對照組比較，P＜0.05

組別　PI3K　p－Akt陽性細胞率/%　IOD　　陽性細胞率/%　IOD對照　45.83±2.89　709.47±208.28　25.46±4.87　2971.43±372.53 1d　65.37±3.621）　971.35±230.46　55.45±3.621）　3132.91±197.21 3d　71.42±4.391）　479.60±170.96　69.59±4.341）　4479.71±342.72 5d　92.18±3.351）　1171.19±263.041）　69.42±3.261）　2446.31±383.67 7d　62.16±4.761）　3316.10±459.082）　92.25±4.481）　3506.14±171.64 9d　73.82±4.341）　2982.60±190.352）　62.26±3.671）　2051.00±288.80 11d　74.80±3.251）　4180.00±131.242）　68.47±4.471）　1976.06±226.762）13d　76.78±4.061）　1753.37±42.411）　72.20±4.641）　1631.75±121.832）17d　81.63±5.321）　878.63±91.32　75.58±4.731）　1345.71±375.402）21d　62.45±3.831）　923.45±143.84　40.29±4.611）　1053.91±253.352）

表3小鼠皮膚損傷后各時間段Western印跡法檢測PI3K、p－PI3K、Akt、p－Akt的平均光密度值（n=5，±s）

表3小鼠皮膚損傷后各時間段Western印跡法檢測PI3K、p－PI3K、Akt、p－Akt的平均光密度值（n=5，±s）

注：1）與相鄰上組比較，P＜0.05；2）與對照組比較，P＜0.05

組別　PI3K　p－PI3K　Akt　p－Akt對照　1.0271±0.1149　0.0092±0.0049　0.9763±0.1250　1.0137±0.1051 1d　0.4028±0.01731）　0.0982±0.00961）2）　0.7912±0.0370　3.1743±0.13911）2）3d　0.5746±0.0214　0.1337±0.00632）　1.0321±0.0589　2.3579±0.29611）2）5d　0.8600±0.13341）　0.0717±0.00641）　1.3521±0.1592　2.2513±0.13361）2）7d　1.6343±0.17851）　0.0592±0.1365　1.6521±0.17061）2）　2.0099±0.23431）9d　1.8364±0.1537　0.0455±0.0130　1.3145±0.2201　1.4993±0.05661）11d　2.3364±0.07831）2）　0.0360±0.0286　1.8050±0.33762）　1.6219±0.19071）13d　1.9551±0.02391）2）　0.0378±0.0346　2.1069±0.33871）2）　1.6859±0.06301）17d　1.8329±0.0362　0.0268±0.0032　1.8082±0.15282）　1.5352±0.06971）21d　1.5560±0.17711）　0.0235±0.0185　1.3278±0.04482）　1.1339±0.0150

2.4 real－time PCR技術

以β－actin為對照，實時定量PCR結果由PRISM? 7500 Real－Time PCR自動采集并給出PI3K、Akt基因的相對含量。損傷組各時間段PI3K mRNA和Akt mRNA的表達水平變化具有一定規(guī)律。傷后1d，PI3K mRNA表達第一次達到峰值；3d略有下降；5～11d表達逐漸升高，于11d再次達到峰值；隨后表達逐漸下降。傷后1～9d，Akt mRNA表達逐漸升高，于9d達到峰值；隨后表達逐漸下降（表4）。

表4小鼠皮膚損傷后各時間段real－time PCR技術檢測PI3K、Akt的mRNA相對含量（n=5，±s）

表4小鼠皮膚損傷后各時間段real－time PCR技術檢測PI3K、Akt的mRNA相對含量（n=5，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與相鄰上組比較，P＜0.05

組別　PI3K mRNA　Akt mRNA對照　1.0000±0.0000　 1.0000±0.0000 1d　 2.7696±0.2000　 1.2982±0.1350 3d　 2.1051±1.9719　 1.3566±0.0215 5d　 1.3081±0.6924　 1.4412±0.5439 7d　 1.8136±0.5723　 1.7477±0.35691）2）9d　 3.0835±1.37831）2）　2.1005±0.33802）11d　 3.6083±2.3738　 1.7487±0.36172）13d　 2.1444±2.25461）2）　1.2467±0.04791）17d　 1.8433±0.4112　 1.1936±0.1461 21d　 1.9345±0.9843　 1.3260±0.3368

3討　論

當細胞受到細胞因子、理化因素等刺激時，PI3K/Akt信號通路激活，參與調節(jié)細胞增殖、分化和凋亡的過程[5]。目前，針對PI3K/Akt的研究大多通過檢測Akt 及p－Akt反映通路的活化情況[6]。

前期研究結果[7－9]表明，小鼠皮膚損傷愈合過程中p38MAPK、JNK、iNOS、eNOS、caspase－8、caspase－9、calpain等多個凋亡相關因子的表達變化具有時間規(guī)律性，可以用于損傷時間推斷，同時認為細胞凋亡在小鼠皮膚損傷愈合過程中發(fā)揮重要的作用，即多種參與皮膚損傷愈合過程的細胞通過細胞凋亡來維持其數量的穩(wěn)定[7]；凋亡相關的caspase－3、caspase－6、caspase－7在損傷區(qū)的中性粒細胞中也呈規(guī)律性表達[8－9]； Zhu等[10]研究表明，加入caspase廣譜抑制劑不能抑制中性粒細胞凋亡，同時發(fā)現在凋亡過程中，p－Akt表達減弱；若PI3K/Akt信號通路過度表達，則可抑制中性粒細胞的凋亡。Knall等[11]研究表明，IL－8通過PI3K/Akt信號通路介導中性粒細胞遷移。Kuo等[12]在研究TPA誘導的皮膚炎癥過程中發(fā)現，厚樸酚通過抑制PI3K/Akt信號通路發(fā)揮抑制炎癥的作用。Sun 等[13]證實，在炎癥過程中PI3K/Akt信號通路的抑制劑是通過抑制促炎因子的釋放來抑制炎癥。本實驗觀察到在皮膚損傷炎癥期，PI3K、p－Akt在中性粒細胞有較高的陽性細胞率，同時Western印跡法結果顯示，p－PI3K、p－Akt表達水平明顯升高，推測可能與p－PI3K、p－Akt發(fā)揮促進中性粒細胞活化和遷移相關；而p－PI3K、p－Akt表達高峰分別出現在3d、1 d，可能與Akt的磷酸化存在其他機制相關[14]。

在損傷愈合過程中發(fā)揮清除異物及壞死物質作用的巨噬細胞，可以分為促炎M1和抗炎M2兩種亞型[15]。有研究[16]表明，PI3K/Akt信號通路在單核細胞分化為M2型的過程中發(fā)揮重要的作用。本研究中，免疫組織化學染色和Western印跡法結果顯示，PI3K、p－Akt在損傷增殖期高表達，推測可能與PI3K/Akt在巨噬細胞增殖和分化中發(fā)揮作用有關。

前期研究[17－18]表明，在皮膚損傷愈合過程中，成纖維細胞的募集和分化具有時間規(guī)律性，可以用于損傷時間推斷[17]。Kondo等[18]研究證實皮膚損傷愈合過程中巨噬細胞和成纖維細胞均表達Fas/FasL，部分共同表達Fas/FasL的細胞發(fā)生凋亡。有研究[19]表明，TGF－β通過激活PI3K/Akt信號通路促進人肺成纖維細胞胞外基質合成，促進肺纖維化。博來霉素通過PI3K/Akt信號通路來提高肺成纖維細胞增殖和膠原蛋白表達，直接發(fā)揮促纖維化的作用[20]。本研究發(fā)現，PI3K 和Akt的表達量在組織重建期明顯增高，PI3K mRNA 和Akt mRNA的表達峰值略早于其蛋白表達的峰值，推測可能由于從mRNA到合成蛋白需要一定的時間有關。

本實驗結果表明，正常皮膚中，PI3K、p－Akt在表皮、毛囊、皮脂腺中表達；在皮膚損傷愈合過程中PI3K、p－Akt在中性粒細胞、巨噬細胞、成纖維細胞中表達，其陽性細胞率隨時間呈規(guī)律性的表達變化。在皮膚損傷愈合的炎癥期，p－PI3K、p－Akt表達明顯升高，而PI3K、Akt變化不明顯，表明炎癥期檢測p－PI3K、p－Akt的變化更有利于損傷時間推斷。PI3K、p－Akt的陽性細胞率峰值出現在增殖期，推測可能與PI3K、Akt發(fā)揮增殖作用及巨噬細胞和成纖維細胞表達重疊相關。在組織重建期，PI3K和Akt表達明顯升高可能與其在成纖維細胞發(fā)揮促進皮膚纖維化有關，同時Western印跡法和real-time PCR檢測結果表明PI3K和Akt的表達變化推斷損傷時間更易觀測。在皮膚損傷愈合過程中，PI3K和Akt的表達變化呈現一定的時間規(guī)律，PI3K和Akt有望用于皮膚損傷時間推斷。

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（本文編輯：劉寧國）

Effects of PI3K/Akt Pathway in Wound Healing Process of Mice Skin

GAO Yan-ling1,2, LIU Chang-sheng3, ZHAO Rui1, WANG Lin-lin1, LI Shan-shan1, LIU Min1, ZHANG Miao1, JIANG Shu-kun1, TIAN Zhi-ling1, WANG Meng1, GUAN Da-wei1
（1. Department of Forensic Pathology, School of Forensic Medicine, China Medical University, Shenyang 110001, China; 2. Criminal Police Branch, Public Security Bureau of Suzhou, Suzhou 215000, China; 3. Department of Technology, People’s Procuratorate of Anshan, Anshan 114001, China）

Abstract：Objective To investigate the expressions and time-dependent changes of phosphatidylinositol-3-kinase（PI3K）, phospho-P13K（p-PI3K）, protein kinase B（PKB/Akt）and phospho-Akt（p-Akt）during wound healing process of mice skin. Methods The changes of PI3K, p-PI3K, Akt and p-Akt expression in skin wound were detected by immunohistochemistry, Western blotting and real-time PCR. Results Immunohistochemistry showed the expression of PI3K and p-Akt were observed in mononuclear and fibroblast after skin wound, and reached peak in reconstruction. The positive bands of PI3K, p-PI3K, Akt and p-Akt were observed in all time points of the wound healing process by Western blotting. The expression peak of p-PI3K and p-Akt showed in inflammation and proliferation; the expression peak of PI3K and Akt in reconstruction. Real-time PCR showed the expression peak of PI3K mRNA in inflammation and reconstruction and the peak of Akt mRNA in reconstruction. Conclusion During the wound healing process, the expressions of PI3K, Akt, p-PI3K and p-Akt show different changes with significant correlation to wound time. The expression of PI3K/Akt may be a valuable marker for wound time estimation. Key words：forensic pathology; wounds and injuries; skin; phosphatidylinositol 3-kinase; phospho-PI3K; protein kinase B; phospho-Akt; mice

收稿日期：（2014-05-23）

通信作者：官大威，男，博士，教授，博士研究生導師，主要從事法醫(yī)病理學教學、科研和鑒定；E-mail：dwguan@mail.cmu.edu.cn

作者簡介：高彥令（1987—），男，碩士研究生，主要從事法醫(yī)病理學科研和教學；E-mail：gaoyanling_0116@126.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81273342）；鞍山市科學技術項目（2060499）

文章編號：1004-5619（2016）01-0007-06

中圖分類號：DF795.1

文獻標志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.01.002