■李　丹　邱　靜　谷　旭　李軍國　楊曙明

（1.中國農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所農業(yè)部農產品質量安全重點實驗室，北京100081；2.中國農業(yè)科學院飼料研究所，北京100081）

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不同大豆原料中單寧含量的差別分析

■李丹1邱靜1谷旭2李軍國2楊曙明1

（1.中國農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所農業(yè)部農產品質量安全重點實驗室，北京100081；2.中國農業(yè)科學院飼料研究所，北京100081）

摘要：文章改進了國標測定單寧所采用的分光光度方法，以鎢酸鈉-磷鉬酸混合溶液顯色后與高效液相色譜檢測相結合，在760 nm紫外波長處進行測定，實現(xiàn)了批量樣品的自動進樣分析，大大簡化了樣品的分析過程，方法在1～6 mg/l范圍內具有良好的線性關系，而且測定實際樣品的結果與分光光度法的結果一致。用該方法檢測了176個大豆飼料原料樣品，并依據(jù)原料加工工藝和分布地域進行分析，結果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵豆粕中的單寧平均含量（5 365.0±749.0）mg/kg明顯高于普通豆粕、膨化豆粕和膨化大豆，而在國內七大地域中，西南地區(qū)中大豆飼料原料中單寧的平均含量（3 758.0±1 296.6）mg/kg最高。

關鍵詞：單寧；高效液相色譜；飼料原料；豆粕；含量

單寧又名鞣酸、單寧酸，是一種高度聚合的多羥基酚物質，分子量約為1 700～2 000，具有生物活性，廣泛存在于植物的葉、莖、皮、果內，是植物資源綜合利用的對象（李金鳳，2010），也廣泛用于化工、食品、醫(yī)藥和冶金等領域。單寧可分為水解單寧和縮合單寧，許多谷物籽實和油料籽實中都含有單寧，如豆類籽實、木薯、馬鈴薯、高粱、橡籽、草籽等，這些籽實類及加工產品都是常用的飼料原料。在飼料衛(wèi)生學中單寧被視為抗營養(yǎng)因子，飼料中單寧含量過高會影響飼用價值，飼料中高含量單寧會影響動物的食欲，降低采食量、營養(yǎng)物質的消化利用率，甚至引起胃腸道疾病和毒害肝腎（李德發(fā)，2001）。大豆制品作為常用的飼料原料，經過不同工藝處理后其中單寧的含量均不相同，因此本文對比分析了普通豆粕、發(fā)酵豆粕、膨化大豆、膨化豆粕四種不同的原料中單寧的含量，同時對比了不同地域范圍內大豆制品中單寧的含量，為畜禽飼料的配制加工、原料選用等提供了重要的參考和支撐。

目前國內外對單寧測定的方法主要有分光光度法、皮粉法（張辭海等，2013;中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會，2000），干酪素法（程立方等，1995），滴定法（何照范，1982），高效液相色譜法（HPLC）（郭佳莉等，2007；何和明等，1996）等，其中分光光度法應用最為普遍，根據(jù)其顯色原理不同，常用的有檸檬酸鐵氨法（任建軍，2006；中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，2008），釩顯色法（霍權恭等，1996），鎢酸鈉法（中華人民共和國農業(yè)部，2008；潘娟等，2012；王勇等，2011；中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，2011），鐵氰化鉀法（黃春芳等，2002），高碘酸鉀氧化亞甲基藍褪色動力學法（王術皓等，2004）等?，F(xiàn)行國家標準GB/T 27985-2011（中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，2011）采用分光光度法測定飼料中單寧的含量，但分光光度法操作相對復雜，在檢測大批量樣品時需要逐個手動灌裝和更換比色皿，檢測效率較低。本實驗以GB/T 27985-2011為基礎，改進了樣品儀器檢測方法，采用高效液相色譜實現(xiàn)了大批量大豆飼料原料樣品的高效率測定。

1　實驗方法

1.1儀器和試劑

鎢酸鈉(Na2O4W·2H2O)，磷鉬酸(H3Mo12O40P·XH2O),無水碳酸鈉（Na2CO3），磷酸為分析純，丙酮為色譜純，超純水，單寧標準品。單寧酸工作液：精確稱取單寧標準品，以超純水溶解定容，配制成1 000 mg/l的單寧儲備液，于4℃保存待用。精確量取10 ml單寧儲備液，以水定容至200 ml，配制成50 mg/kg的標準工作液。顯色劑Ⅰ：鎢酸鈉-磷鉬酸混合溶液，精確稱取100.0 g鎢酸鈉，20.0 g磷鉬酸，溶于約750 ml水中，移入1 000 ml回流瓶中，加入50 ml磷酸，充分混勻，接冷凝管，沸水浴上加熱回流2 h，冷卻，移入容量瓶中以水定容至1 000 ml，搖勻，于棕色瓶中，常溫下儲存待用，使用期限14 d。顯色劑Ⅱ：75 g/l碳酸鈉水溶液，準確稱取37.5 g無水碳酸鈉于250 ml溫水中，充分溶解混勻，冷卻稀釋至500 ml，于儲存瓶中常溫下備用，期限14 d。

高效液相色譜儀（Waters 2695），配置四元泵和二極管陣列檢測器（PDA，Waters 2998），紫外檢測波長為760 nm。流動相：超純水；進樣體積：10 μl；流速：1.0 ml/min。無需液相色譜柱，試樣經自動進樣器導入系統(tǒng)后隨流動相直接進入檢測器測定。

1.2實驗操作

參照國標GB/T 27985-2011方法，準確稱取樣品2 g（精確至0.01 g），置于250 ml具塞三角瓶中，加入50 ml丙酮?水（1?1），加塞密封，振蕩提取30 min，靜置后，以定性濾紙過濾，收集全部濾液，充分混勻后取出1 ml，置于盛有約30 ml水的50 ml棕色容量瓶中，搖勻，加入2.5 ml顯色劑Ⅰ，5 ml顯色劑Ⅱ，以水定容至50 ml，搖勻后靜置30 min顯色。過0.22 μm水系微孔濾膜后，上HPLC檢測。

2　結果與討論

2.1HPLC流動相優(yōu)化

本實驗對比了純甲醇，甲醇/水（95?5，V/V），純乙腈，乙腈/水（95?5，V/V）和純水對單寧測定的影響。結果發(fā)現(xiàn)，甲醇/水與乙腈/水兩種流動相獲得的單寧色譜峰形不對稱，而使用純甲醇和純乙腈時，不同濃度標準品受流動相的影響，其響應卻基本相似，不呈線性變化趨勢。只有將純水作為流動相的條件下，單寧才能獲得理想的色譜峰形，而且濃度和峰面積之間呈現(xiàn)出較好的線性相關關系。

2.2標準曲線

精確移取適量單寧工作液，分別置于盛有約30 ml水的50 ml容量瓶中，搖勻，加入2.5 ml顯色劑Ⅰ和5 ml顯色劑Ⅱ，以水定容至50 ml，搖勻后靜置30 min顯色，配制成0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/l標準系列工作液。過0.22 μm水系微孔濾膜后，上HPLC檢測。以單寧標準溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制得到標準曲線方程為y=14 053x+6 345.9，相關系數(shù)R為0.999。典型的單寧標準溶液色譜見圖1，豆粕樣品色譜如圖2所示。

圖1　單寧標準溶液（1 mg/l）液相色譜

2.3方法準確性驗證

GB/T 27985-2011采用鎢酸鈉-磷鉬酸混合溶液顯色，以分光光度法檢測單寧，由于分光光度法需人工對樣品進行逐個清洗、檢測、記錄，不但需要大量的時間和精力，而且反復的沖洗、潤洗造成了各種溶液的浪費，增加了環(huán)境的壓力，因此不適用于大批量樣品的快速檢測。本實驗使用高效液相色譜法替代分光光度法，以超純水作流動相分析樣品，無需色譜柱分離而直接進入PDA檢測器測定，不僅實現(xiàn)了樣品的批量自動進樣，而且大幅縮短了檢測時間，提高了檢測效率。

圖2　隨機檢測豆粕樣品的液相色譜

由于本方法采用的是GB/T 27985-2011規(guī)定的前處理方法，該標準已經經過了嚴格的方法驗證和評價，而本實驗所做的改進僅僅是檢測儀器不同，因此無需再對整個方法進行系統(tǒng)的方法學考察。但為了進一步驗證本方法的準確性，隨機抽取了一定數(shù)量的飼料原料樣品，分別采用高效液相色譜法和分光光度法檢測，結果（見表1）表明兩者之間的相對標注偏差均低于5.81%，因此改進后的高效液相色譜法與原國標GB/T 27985-2011中的分光光度法檢測結果基本一致，說明本方法準確可行。

2.4不同工藝大豆飼料原料中單寧含量的分布

本實驗從國內20個省市抽取了176個大豆原料，其中包括120個普通豆粕，6個膨化豆粕，33個膨化大豆，17個發(fā)酵豆粕，其中單寧含量的基本檢測情況如圖3所示。

表1　高效液相色譜法和分光光度法檢測結果對比

圖3　不同工藝生產的大豆飼料原料的單寧含量對比

四種類型的飼料原料中單寧的含量由高到低依次為：①發(fā)酵豆粕，平均含量為（5 365.0±749.0）mg/kg，檢出值在3 239.8～6 214.2 mg/kg范圍內；②豆粕，平均含量為（3 49.7±501.0）mg/kg，檢出值在2 010.7～ 4 966.0 mg/kg范圍內；③膨化大豆，平均含量為(3 117.6±443.2) mg/kg，檢出值在2 122.4～3681.6 mg/kg范圍內；④膨化豆粕，平均含量為(2 896.2±335.6) mg/kg，檢出值在2 317.2～3 307.2 mg/kg范圍內。相對而言，發(fā)酵豆粕中單寧平均含量最高，而普通豆粕、膨化豆粕和膨化大豆的含量總體相近。發(fā)酵豆粕是利用現(xiàn)代生物工程發(fā)酵菌種技術與中國傳統(tǒng)的固體發(fā)酵技術相結合，以優(yōu)質豆粕為主要原料，接種微生物，經微生物的發(fā)酵而形成的豆粕。原豆粕中的大分子物質被微生物分解，大豆蛋白被降解為優(yōu)質小肽蛋白源，并產生了益生菌、寡肽、谷氨酸、乳酸、維生素、UGF（未知生長因子）等活性物質，而抗營養(yǎng)因子單寧也會被最大程度的游離出來，以致發(fā)酵豆粕中的單寧平均含量相對其他工藝生產的飼料原料較高。

2.5不同地區(qū)大豆飼料原料中單寧含量的分布

根據(jù)國內七大區(qū)域劃分，對具有明確采樣地區(qū)信息的174個大豆飼料原料進行單寧含量分布分析，結果如表2所示。七大地區(qū)大豆飼料原料樣品中的單寧含量高低依次為：西南地區(qū)（3 758.0±1 296.6）mg/kg，華北地區(qū)（3 510.4±982.0）mg/kg，華南地區(qū)（3 493.4± 1 000.5）mg/kg，華東地區(qū)（3 315.5±649.6）mg/kg，西北地區(qū)（3 251.3±729.3）mg/kg，東北地區(qū)（3 100.6± 444.1）mg/kg，華中地區(qū)（3 038.3±731.4）mg/kg。相比較而言，西南地區(qū)大豆飼料原料中的單寧平均含量最高，而華中地區(qū)的含量最低。

表2　不同地區(qū)大豆飼料原料中單寧含量的檢測統(tǒng)計情況（mg/kg）

潘娟等（2012）檢測了飼料中的單寧含量，結果發(fā)現(xiàn)大豆餅粕中單寧的平均含量為4 033.0 mg/kg，在本實驗所檢測樣品的含量范圍內。作為飼料原料的豆粕中單寧含量普遍高于禽畜配合料中單寧的含量（1 180～2 377）mg/kg，原因可能是配合料中加入了其他種類的飼料原料，對豆粕中的單寧進行了稀釋，也可能是因為配合料在后期加工過程中，部分加工工藝會造成單寧含量的降低。

3　結語

本實驗在GB/T 27985-2011基礎上，使用高效液相色譜法替代分光光度法測定飼料原料中單寧的含量，實現(xiàn)了大批量樣品的自動進樣分析，顯著縮短了儀器分析時間，使得該方法更適用于批量樣品的快速檢測。大豆飼料原料的檢測結果表明其中含有的單寧含量普遍較高，發(fā)酵豆粕由于微生物發(fā)酵的處理，其單寧平均含量要高于其他3種飼料原料，而西南地區(qū)的含量則要高于其他六大地區(qū)。本實驗的方法和結果為畜禽飼料的配制加工、原料選用、單寧含量的測定等提供了重要的參考和支撐。

參考文獻

[1]李金鳳，段馬，張海暉，等.板栗殼中多酚的提取及體外抗氧化性研究[J].林產化學與工業(yè)，2010，30（1）：53-58.

[2]李德發(fā).中國飼料大全[M].北京：中國農業(yè)出版社，2001.

[3]張辭海，歐陽玉祝.紫外皮粉法測定倍花中單寧酸含量[J].吉首大學學報（自然科學版），2013，34（2）：68-71.

[4]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].廣東：廣東科技出版社，2000.

[5]程立方，田櫻.干酪素法測定側柏葉中鞣質含量[J].時珍國藥研究，1995，6（3）: 13-14.

[6]何照范.快速絡合滴定法測定刺梨中單寧含量[J].分析化學，1982，11（8）：610-612.

[7]郭佳莉，李國清，蔡英卿，等.高效液相色譜法測定余甘子中單寧酸的含量[J].光譜實驗室，2007，24（5）：911-913.

[8]何和明，何健.反相高效液相色譜法測定檳榔花單寧酸含量[J].現(xiàn)代應用藥學，1996，13（1）：19-21.

[9]任建軍.高粱中單寧含量的測定分析[J].食品工業(yè)科技，2006，27 （2）：175-176.

[10]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局. GB/T 15686-2008[S].高粱單寧含量的測定.北京：中國標準出版社，2008-11-04.

[11]霍權恭，蔡鳳英.高粱單寧釩顯色測定法[J].食品科學，1996，17 （12）：56-58.

[12]中華人民共和國農業(yè)部. NY/T 1600-2008[S].水果、蔬菜及其制品中單寧含量的測定分光光度法.北京：中國標準出版社，2008-06-15.

[13]潘娟，商軍，黃士新.鎢酸鈉-磷鉬酸比色分光光度法測定飼料中的單寧[J].飼料工業(yè)，2012，33（7）：51-55.

[14]王勇，王富忠，萬濤.分光光度法測定澀柿中柿單寧含量[J].分析實驗室，2011，30（8）：16-18.

[15]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局. GB/T 27985-2011[S].飼料中單寧的測定分光光度法.北京：中國標準出版社，2011-12-30.

[16]黃春芳，倪永年.分光光度法測定食品中的單寧[J].南昌大學學報（理科版），2002，26（3）：243-246.

[17]王術皓，牛學麗，杜凌云.單寧協(xié)同高碘酸鉀氧化亞甲基藍褪色動力學光度法測定單寧[J].分析化學，2004，32（6）：839.

（編輯：文奇男，wenqinan@sohu.com）

Analysis of the difference of tannin content in soybean seed

Li Dan, Qiu Jing, Gu Xu, Li Junguo, Yang Shuming

Abstract：In this paper，high performance liquid chromatography（HPLC）was used to replace the spec?trophotometric method for the determination of tannin in feed, while tannin was colored by sodium tungstate - phosphomolybdic acid mixture and then detected at 760 nm using UV detector. This meth?od has a good linearity within 1～6 mg/l, and some results of real samples were consistent with those from spectrophotometric method. Then the method was successfully applied to detect 176 samples from soybean, the results showed that average content of tannin in fermented soybean meal (5 365.0± 749.0) mg/kg is significantly higher than ordinary soybean meal, expanded soybean meal and expanded soybean. While in domestic seven areas, the highest average content of tannininsoybean feed (3 758.0± 1 296.6) mg/kg is observed in the southwest area.

Key words：tannin；hplc；feed；soybean meal；content

基金項目：公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項經費項目[201203015]

收稿日期：2015-11-05

通訊作者：邱靜，博士，研究員。

作者簡介：李丹，碩士，主要從事分析化學方法的開發(fā)與研究。

中圖分類號：S816.32

文獻標識碼：A

文章編號：1001-991X（2016）01-0038-04

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.01.008