曾濤濤，李　冬，曾輝平，張　昭，李相昆，張　杰,

(1.污染控制與資源化技術(shù)湖南省高校重點實驗室(南華大學(xué))，421001 湖南 衡陽； 2.水質(zhì)科學(xué)與水環(huán)境恢復(fù)工程北京市重點實驗室(北京工業(yè)大學(xué))，100124北京； 3.中國建筑科學(xué)研究院建筑設(shè)計院，100013 北京；4.城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室(哈爾濱工業(yè)大學(xué))，150090哈爾濱)

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常溫低基質(zhì)亞硝化反應(yīng)器功能菌群解析

曾濤濤1，李冬2，曾輝平2，張昭3，李相昆4，張杰2,4

(1.污染控制與資源化技術(shù)湖南省高校重點實驗室(南華大學(xué))，421001 湖南 衡陽； 2.水質(zhì)科學(xué)與水環(huán)境恢復(fù)工程北京市重點實驗室(北京工業(yè)大學(xué))，100124北京； 3.中國建筑科學(xué)研究院建筑設(shè)計院，100013 北京；4.城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室(哈爾濱工業(yè)大學(xué))，150090哈爾濱)

摘要:為維持亞硝化反應(yīng)器穩(wěn)定運行提供微生物理論基礎(chǔ)，以常溫(18～21.5 ℃)低基質(zhì)推流式亞硝化反應(yīng)器為對象，解析其穩(wěn)定運行期間功能菌群特征.通過檢測反應(yīng)器三氮變化檢驗其亞硝化效果.利用掃描電鏡(SEM)觀察污泥微觀結(jié)構(gòu)，通過熒光原位雜交(FISH)、變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)及克隆測序等方法，解析微生物菌群特性.保持反應(yīng)器低溶解氧環(huán)境(0.1～0.6 mg/L)，使氨氧化菌(AOB)競爭力強于亞硝酸鹽氧化菌(NOB)，在連續(xù)流運行80 d內(nèi)，平均亞硝化率幾乎為100%，出水NO2--N與NH4+-N質(zhì)量比穩(wěn)定在1.11. SEM結(jié)果顯示，亞硝化污泥中球形細(xì)菌為優(yōu)勢菌群.FISH結(jié)果顯示，AOB與NOB的相對比例分別為37.3%與4.4%.PCR-DGGE結(jié)果表明，反應(yīng)器內(nèi)存在6類優(yōu)勢微生物菌群，其中Nitrosomonas sp.為功能微生物AOB.由多種微生物組成的功能菌群維持反應(yīng)器亞硝化穩(wěn)定運行.

關(guān)鍵詞:亞硝化；功能菌群；常溫；低基質(zhì)；氨氧化菌；亞硝酸鹽氧化菌

傳統(tǒng)生物脫氮工藝經(jīng)過硝化和反硝化作用兩個階段完成脫氮過程，硝化反應(yīng)包括氨氧化與亞硝酸鹽氧化兩個過程，分別由氨氧化菌(AOB)和亞硝酸鹽氧化菌(NOB)負(fù)責(zé)完成.亞硝化過程就是使硝化反應(yīng)停留在氨氧化階段，避免亞硝酸鹽被氧化成硝酸鹽，從而形成亞硝酸鹽積累.若亞硝化過程與后續(xù)厭氧氨氧化工藝耦合(PN-ANAMMOX)，則只需要將57%的氨氧化成亞硝酸鹽，剩余的氨氮與亞硝酸鹽按如下反應(yīng)式完成脫氮過程[1]，即

NH4++1.31NO2-+0.066HCO3-+0.13H+→

1.02N2+0.26NO3-+0.066CH2O0.5N0.15+2.03H2O.

與傳統(tǒng)硝化/反硝化脫氮作用相比，PN-ANAMMOX理論上可節(jié)省62.5%的曝氣能耗，無需有機碳源，且污泥產(chǎn)量低，受到廣泛關(guān)注[2].若要維持常溫低基質(zhì)生活污水PN-ANAMMOX工藝穩(wěn)定運行，關(guān)鍵在于實現(xiàn)穩(wěn)定的亞硝化過程，即PN反應(yīng)器出水NO2-與NH4+比值穩(wěn)定，實質(zhì)就是控制條件促進AOB生長繁殖而淘汰NOB[3].本研究以經(jīng)過厭氧-好氧(A/O)除磷工藝去除磷及大部分有機物的生活污水為對象，完成亞硝化(PN)反應(yīng)器的啟動.待PN反應(yīng)器穩(wěn)定運行后，通過掃描電鏡(SEM)、熒光原位雜交(FISH)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)等技術(shù)，分析污泥微觀結(jié)構(gòu)、解析功能菌群特性，探索功能菌群與反應(yīng)器亞硝化效果之間的關(guān)系，為促進AOB富集、提高PN反應(yīng)器效能提供理論基礎(chǔ).

1實驗

1.1反應(yīng)器裝置及進水水質(zhì)

反應(yīng)器裝置為不銹鋼制的推流式反應(yīng)器，后面接由有機玻璃制成的豎流式形式二沉池(圖1).主體反應(yīng)器規(guī)格為2.0 m×0.6 m×1.0 m，總?cè)莘e為1.2 m3，分隔成4個相同大小的格室.通過設(shè)置導(dǎo)流孔防止流水返混，保持反應(yīng)器連續(xù)流運行所需的推流條件.A/O除磷工藝的出水用作推流式反應(yīng)器進水，進行亞硝化實驗.根據(jù)運行需要控制每個格室的曝氣量，通過單獨的氣體流量計檢測曝氣強度.二沉池總?cè)莘e為300 L，其中部分污泥進行回流，補充反應(yīng)器污泥濃度.

推流式亞硝化反應(yīng)器接種600 L某污水廠曝氣池末端的污泥(6 650 mg/L)，硝化性能良好.實驗用水為實際生活污水，即北方某生活小區(qū)化糞池污水經(jīng)過厭氧-好氧(A/O)除磷工藝去除大部分磷、COD、BOD，反應(yīng)器進水水質(zhì)如表1所示.按中國國家環(huán)保局頒布的標(biāo)準(zhǔn)方法測定進出水三氮質(zhì)量濃度[4]:氨氮，納氏試劑光度法；亞硝酸鹽氮，N-(1-萘基)-乙二胺光度法；硝酸鹽氮，紫外分光光度法.溫度、pH及溶解氧采用WTW在線pH/DO檢測.

圖1　亞硝化反應(yīng)器裝置

t/℃pHρ(Nh1+-N)/(mg·L-1)ρ(NO2--N)/(mg·L-1)ρ(NO3--N)/(mg·L-1)BOD5/(mg·L-1)COD/(mg·L-1)ρ(TP)/(mg·L-1)21.5-18.07.0~8.060~80<1.0<1.0<15<50<0.5

1.2掃描電鏡(SEM)觀察

收集接種污泥及反應(yīng)器啟動成功后的硝化污泥，進行掃描電鏡觀察微觀結(jié)構(gòu).方法如下：樣品加入磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=8.0)洗滌3次；加入體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛，于冰箱中4 ℃條件下固定2 h；加入磷酸緩沖溶液(PBS，0.1 mol/L，pH=8.0)清洗10 min；之后進行梯度酒精脫水，體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、70%、90%，再用無水乙醇脫水3次，每次10 min；之后進行置換反應(yīng)，即加入無水乙醇與乙酸異戊酯比為1∶1及純乙酸異戊酯各1次，每次15 min；對樣品進行冷凍、真空干燥24 h、噴金，通過掃描電鏡(HITACHIS-4300)觀察污泥微觀結(jié)構(gòu).

1.3熒光原位雜交(FISH)

對接種污泥與硝化污泥進行熒光原位雜交分析，所用探針如表2所示，污泥樣品經(jīng)過預(yù)處理、雜交、洗滌后進行觀察[5].雜交過程所用探針雜交液組成為：體積分?jǐn)?shù)20%～55%的甲酰胺，0.9 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl(pH=7.2)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%的SDS；雜交后洗脫液組分為：56～225 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl (pH=7.2)，10 mmol/L EDTA，0.01%SDS.雜交后的玻片晾干后，通過熒光顯微鏡(BX51)及CellSens Dimension軟件觀察，分析雜交結(jié)果.隨機捕捉20張FISH圖像，利用Image-Pro Plus 6.0軟件分析AOB與NOB所占比例.

表2　熒光原位雜交所用16S rRNA標(biāo)記的探針

1.4變性梯度凝膠電泳(DGGE)及測序分析

1.4.1DNA提取與PCR擴增

采用改進的氯仿-SDS方法提取硝化污泥微生物基因組DNA.取1 g污泥，加入DNA提取液2.7 mL(100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA，1.5 mol/L NaCl，100 mmol/L Na3PO3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CTAB，pH=8.0)、蛋白酶K 50 μL(30 mg/mL)、溶菌酶50 μL(20 mg/mL)，混勻之后在37 ℃水浴、225 r/min條件下震蕩30 min；加入0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的SDS，65 ℃水浴2 h時，期間每隔15 min將樣品管輕搖混勻.水浴完成后將離心管取出，8 000 r/min條件下離心10 min，棄沉淀；上清液加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，混勻后離心10 min(8 000 r/min)；上清液加入0.6倍體積的異丙醇，-20 ℃冷凍過夜，再在4 ℃、10 000 r/min條件下離心5 min，去上清液，沉淀至通風(fēng)處徹底晾干.加入100 μL TE(100 mmol/L Tris-HCl, 100 mmol/L EDTA，pH=8.0)溶解沉淀，-20 ℃保存?zhèn)溆肹6].

采用通用引物GC-338F和907R擴增細(xì)菌16S rRNA基因[9].PCR反應(yīng)管內(nèi)加入提取的基因組DNA1.0 μL，dNTPs(2.5 mmol/L) 2.0 μL，引物GC-338F和907R(20 μmol/L)各0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，Ex Taq酶(5 U/μL) 0.125 μL，加入無菌水至終體積25 μL.采用TaKaRa TP600梯度PCR儀(日本)進行PCR反應(yīng)，94 ℃開始變性5 min；進入循環(huán)反應(yīng)，包括94 ℃、40 s，55 ℃、40 s，72 ℃、1 min 3個步驟，共運行30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃終止PCR反應(yīng).利用DNA純化回收試劑盒(天根，中國)對PCR產(chǎn)物純化回收，并通過瓊脂糖凝膠電泳驗證.

1.4.2DGGE及其結(jié)果分析

DGGE電泳儀器為美國Bio-Rad公司的D-Code System系統(tǒng).通過加入尿素與甲酰胺配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%～60%的變性梯度凝膠，配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的聚丙烯酰胺凝膠進行PCR產(chǎn)物分析.DGGE操作條件為：電壓120 V，電泳溫度與時間分別為60 ℃與8 h，電泳緩沖液為1×TAE.電泳結(jié)束后，將凝膠清洗之后進行銀染[10]，在凝膠成像儀(BioRad)中通過軟件Gel Doc XR獲取銀染后圖像.

1.4.3微生物系統(tǒng)發(fā)育分析

通過銀染，DGGE凝膠出現(xiàn)明顯條帶，對這些條帶進行切割，將其溶于100 μL 1×TE(pH8.0)中，于4 ℃冰箱中過夜.以此為模板，相應(yīng)不帶GC夾的338F與907R為引物，擴增細(xì)菌16S rRNA基因片段.PCR片段進行純化回收，通過T4DNA連接酶連接到載體pMD19-T (TaKaRa)上，42 ℃熱擊，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞EscherichiacoliDpα(天根，中國)中.通過涂布平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，構(gòu)建目的基因克隆文庫.每個DGGE條帶的樣品選取3～5個陽性克隆送交上海生工生物公司進行測序.獲得的序列通過BLAST工具搜索相近序列，進行比對.將序列提交到 GenBank，獲得基因登錄號為KF194203-KF194209.通過MEGA 5.0軟件，以bootstrap-NJ法構(gòu)建相應(yīng)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹.

2結(jié)果與討論

2.1亞硝化反應(yīng)器運行效果

亞硝化反應(yīng)器運行效果可用氨氧化率及亞硝化率來表征，其中氨氧化率(RA)計算方式為

亞硝化率(RN)計算方式為

單位為mg/L.以亞硝化率連續(xù)7個周期超過90%作為亞硝化啟動成功標(biāo)志[11].

在之前的研究中已完成亞硝化反應(yīng)器啟動[12]，過程如下：在A/O除磷反應(yīng)器的出水中人工添加(NH4)2SO4至氨氮質(zhì)量濃度為300 mg/L(游離氨FA為11.36 mg/L)，溫度為室內(nèi)自然溫度(16.4～25.5 ℃).采用間歇操作方式，即經(jīng)過進水(0.5 h)、曝氣與沉淀(1 h)、排水(1 h)、閑置5個階段，對接種污泥進行馴化.對曝氣強度采用實時控制策略[13]，保持DO質(zhì)量濃度0.2～0.8 mg/L，避免延時曝氣.在這種工況下共運行了60個周期，出水NO2--N與NH4+-N質(zhì)量比達1.0～1.30，亞硝化率一直保持90%以上，表明成功啟動亞硝化反應(yīng)器.之后將進水氨氮質(zhì)量濃度降到80 mg/L，按SBR操作方式共運行40個周期，期間氨氧化率在90%左右，而亞硝化率一直在95%以上，說明反應(yīng)器在低氨氮、間歇操作方式下，能保持亞硝化穩(wěn)定運行[14].

此后，反應(yīng)器轉(zhuǎn)變?yōu)槌氐桶钡B續(xù)流運行(本文實驗)，進水流量(Qin)為125～160 L/h，污泥回流量(Q回)為60～80 L/h，水力停留時間(HRT)為7～9 h.調(diào)節(jié)反應(yīng)器4個格室的曝氣強度，分別為4～8 L/min、3～4 L/min、0(只進行缺氧攪拌)、3～5 L/min，保持反應(yīng)器溶解氧(DO)質(zhì)量濃度處于較低水平(0.1～0.6 mg/L).整個80 d運行期間，反應(yīng)器氨氧化率、亞硝化率和出水NO2--N與NH4+-N質(zhì)量比如圖2所示.

由圖2可知，平均氨氮氧化率穩(wěn)定在55%，亞硝化率接近100%，出水NO2--N與NH4+-N質(zhì)量比穩(wěn)定在1.11附近，可為后續(xù)ANAMMOX反應(yīng)提供穩(wěn)定水質(zhì).PN反應(yīng)器亞硝化效果良好，推測AOB得到有效富集，NOB活性受到抑制.以此常溫低氨氮亞硝化反應(yīng)器為對象，分析其功能菌群特性.

圖2　亞硝化反應(yīng)器氨氧化率、亞硝化率與出水亞氮與氨氮比

2.2亞硝化污泥微觀結(jié)構(gòu)

已有研究發(fā)現(xiàn)，Nitrosomonas類AOB數(shù)量較多時能使污泥顏色變黃，這主要是此菌體富含細(xì)胞色素所致[15].亞硝化反應(yīng)器在啟動過程中，就出現(xiàn)污泥顏色變化，由接種時淺黑色逐漸轉(zhuǎn)變成淺黃色，可推測Nitrosomonas類AOB數(shù)量逐漸增多.通過掃描電鏡，對接種污泥與亞硝化污泥進行微觀結(jié)構(gòu)對比分析，結(jié)果如圖3所示.

亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)和亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)是在污水生物脫氮處理過程中經(jīng)常出現(xiàn)的AOB菌屬，形態(tài)分別為短桿狀或球狀，而NOB主要為硝化桿菌屬(Nitrobacter)與硝化螺菌屬(Nitrospira)，對應(yīng)形態(tài)分別為桿狀或螺旋狀.由圖3(a)可知，接種污泥中微生物種類較多，有桿狀菌、短桿菌和球形菌(黑色線圈標(biāo)注)；而在亞硝化污泥中(圖3(b))，短桿菌、球形細(xì)菌較多(黑色線圈標(biāo)注).郭建華等[16]曾經(jīng)分析了短程硝化過程中種群結(jié)構(gòu)的演變，SEM結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種污泥中含有桿菌、短桿菌、球形菌以及絲狀菌等多種形態(tài)微生物，而隨著短程硝化的啟動與穩(wěn)定，污泥中短桿菌和球菌數(shù)量增多，成為優(yōu)勢菌群，本實驗亦有類似變化趨勢.為進一步了解反應(yīng)器內(nèi)AOB與NOB豐度，開展污泥的熒光原位雜交(FISH)實驗，分析AOB與NOB的相對比例關(guān)系.

圖3　接種污泥與亞硝化污泥掃描電鏡結(jié)果

2.3反應(yīng)器功能菌群FISH分析

PN反應(yīng)器啟動成功后，亞硝化率接近100%，可推測AOB為優(yōu)勢菌群，NOB得到有效抑制.SEM結(jié)果也表明污泥微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，但這都不能直接說明污泥中AOB或NOB數(shù)量的多寡.因此，對接種污泥與亞硝化污泥微生物進行FISH檢測，對其中AOB與NOB分布及相對比例進行定量考察.選取代表性AOB、NOB熒光照片及真細(xì)菌熒光照片，通過Image-Pro Plus 6.0軟件進行分析，結(jié)果如圖4所示.圖4(a)和(c)中亮點部分代表AOB(Nitrosomonas)的分布，暗色部分為真細(xì)菌.同理，圖4(b)和(d)中亮度高的部分代表NOB(Nitrobacter)的分布，顏色較暗部分為真細(xì)菌.

對FISH結(jié)果統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，接種污泥中Nitrosomonas-AOB與Nitrobacter-NOB的相對比例分別為35%和21%，說明AOB與NOB均是其中優(yōu)勢菌屬，原因是接種污泥是從全程硝化反硝化脫氮污水處理廠中取樣.本實驗中，亞硝化污泥中Nitrosomonas-AOB相對比例略有升高，為37.3%，而Nitrobacter-NOB相對比例下降明顯，僅為4.4%，這表明反應(yīng)器中AOB成為優(yōu)勢菌群，而NOB逐漸淘汰.之前有研究發(fā)現(xiàn)，實時控制的SBR小型反應(yīng)器短程硝化運行135 d后，AOB數(shù)量占絕對優(yōu)勢，NOB得到抑制與淘洗[16].Sinha等[17]利用FISH方法，分析了連續(xù)流系統(tǒng)中短程硝化前后的污泥菌群比例，發(fā)現(xiàn)隨著反應(yīng)器短程硝化的運行，AOB所占比例從接種污泥的2%～3%上升至短程硝化污泥的48%～53%，NOB比例較低，為6%～8%.這些研究表明，反應(yīng)器在不同運行方式及不同控制參數(shù)影響下，AOB及NOB種群結(jié)構(gòu)會發(fā)生明顯變化.本實驗中反應(yīng)器在連續(xù)流運行時間內(nèi)，AOB為優(yōu)勢菌群，NOB活性得到有效抑制，數(shù)量較少.

(a)和(c)中亮點部分表示Cy3標(biāo)記NSO190探針與AOB(Nitrosomonas)的雜交結(jié)果，(b)和(d)中亮度較高部分表示HEX標(biāo)記的NIT3探針與NOB(Nitrobacter)的雜交結(jié)果；(a)～(d)中暗色部分代表FITC標(biāo)記的Eub338mix 探針(EUB338、EUB338-Ⅱ和EUB338-Ⅲ)與真細(xì)菌雜交結(jié)果；標(biāo)尺為20 μm.

圖4接種污泥及亞硝化污泥熒光原位雜交分析

2.4微生物群落結(jié)構(gòu)解析

以亞硝化污泥為對象，通過提取基因組DNA、GC338F/907R引物擴增16S rDNA基因、DGGE等步驟，分析微生物群落組成；對DGGE條帶切膠、PCR、克隆測序，獲得的序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果如圖5所示.

由圖5(a)可知，主要有6類優(yōu)勢菌群存在PN反應(yīng)器內(nèi)，其中條帶3測序結(jié)果與Nitrosomonassp.(HF678378)相似度為96%，表明此類氨氧化菌為PN反應(yīng)器內(nèi)功能菌，負(fù)責(zé)維持亞硝化過程穩(wěn)定運行.條帶1測序結(jié)果與Blastochlorissp.(AJ401203)相似度為96%.Blastochlorissp.為芽生綠菌屬細(xì)菌，革蘭氏染色為陰性，形態(tài)有桿形或卵圓形，異養(yǎng)厭氧生長或者微好氧生長.條帶2與Pseudomonassp.(HE603527)同源性最高，相似度為99%.Pseudomonassp.為假單胞菌屬，為常見的反硝化細(xì)菌，此類細(xì)菌的存在能夠消耗一部分有機物，這可能與進水中含有少量COD相適應(yīng).

而條帶4與綠彎菌門細(xì)菌Chloroflexibacterium(EU875524)相似度為90%，該類細(xì)菌為常見的絲狀菌，常在生物脫氮除磷系統(tǒng)中出現(xiàn)[18]，可在活性污泥形成中起到骨架作用，有利于菌膠團的形成.條帶5與α變形綱的食羧寡養(yǎng)菌Oligotrophacarboxidovorans(AB099660)同源性最高，相似度為99%，該菌種也是活性污泥中常見的微生物[19].而條帶6與δ變形綱的侏囊菌屬細(xì)菌Nannocystisaggregans(AJ233945)相似度為95%，后者屬于粘細(xì)菌的一種[20]，該類菌為革蘭氏陰性菌，屬于好氧化能有機營養(yǎng)型細(xì)菌，難以獲得純培養(yǎng).

綜上，PN反應(yīng)器主要以自養(yǎng)型Nitrosomonassp.功能微生物為主，負(fù)責(zé)氨氧化過程；此外還存在一些異養(yǎng)菌，如Pseudomonassp.、Chloroflexibacterium及Blastochlorissp..這些異養(yǎng)菌的存在并沒有影響反應(yīng)器亞硝化效果，推測原因是進水中有機物很少(COD小于50 mg/L，BOD5小于15 mg/L)，異養(yǎng)菌不能大量繁殖.

圖5　PN反應(yīng)器全細(xì)菌DGGE結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹

3結(jié)論

1)通過高氨氮進水與低溶解氧聯(lián)合抑制NOB活性方式，成功啟動亞硝化反應(yīng)器.此后在低基質(zhì)連續(xù)流運行80 d內(nèi)，繼續(xù)保持低溶解氧濃度，可使反應(yīng)器出水NO2--N與NH4+-N質(zhì)量比穩(wěn)定，獲得良好的亞硝化效果.

2) PN反應(yīng)器中，亞硝化污泥中以球形菌與短桿菌為主，Nitrosomonas類AOB為優(yōu)勢菌群，相對比例為37.3%，NOB活性被抑制，數(shù)量逐漸減少，相對比例為4.4%.

3)對微生物群落結(jié)構(gòu)進行解析，發(fā)現(xiàn)PN反應(yīng)器存在6類優(yōu)勢微生物，即Blastochlorissp.、Pseudomonassp.、Nitrosomonassp.、Chloroflexibacterium、Oligotrophacarboxidovorans與Nannocystisaggregans，其中Nitrosomonassp.為功能微生物AOB，可與其他微生物和諧共存，維持亞硝化反應(yīng)器穩(wěn)定運行.

參考文獻

[1] KARTAL B, KUENEN J G, VAN LOOSDRECHT M C. Engineering sewage treatment with anammox [J]. Science, 2010, 328(5979): 702-703.

[2] LACKNER S, GILBERT E M, VLAEMINCKS E, et al. Full-scale partial nitritation/anammox experiences-an application survey [J]. Water Research, 2014, 55: 292-303.

[3] 曾薇, 張悅, 李磊, 等. 生活污水常溫處理系統(tǒng)中AOB與NOB競爭優(yōu)勢的調(diào)控 [J]. 環(huán)境科學(xué), 2009, 30(5): 1430-1436.

[4] 國家環(huán)境保護總局. 水和廢水監(jiān)測分析方法[M].4版. 北京: 中國環(huán)境科學(xué)出版社, 2002.

[5] ZHANG Z, CHEN S, WU P, et al. Start-up of the CANON process from activated sludge under salt stress in a sequencing batch biofilm reactor (SBBR) [J]. Bioresource Technology, 2010, 101(16):6309-6314.

[6] 曾濤濤. 常溫低基質(zhì) PN-ANAMMOX 耦合工藝脫氮效能及微生物特性研究[D]. 哈爾濱: 哈爾濱工業(yè)大學(xué), 2013.

[7] DAIMS H, BRüHL A, AMANN R, et al. The domain-specific probe Eub338 is insufficient for the detection of all bacteria: development and evaluation of a more comprehensive probe set [J]. Systematic and Applied Microbiology, 1999, 22(3): 434-444.

[8] MOBARRY B K, WAGNER M, URBAIN V, et al. Phylogenetic probes for analyzing abundance and spatial organization of nitrifying bacteria [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(6): 2156-2162.

[9] GONG Z, LIU S, YANG F, et al. Characterization of functional microbial community in a membrane-aerated biofilm reactor operated for completely autotrophic nitrogen removal [J]. Bioresource Technology, 2008, 99(8): 2749-2756.

[10]BASSAM B J, GRESSHOFF P M. Silver staining DNA in polyacrylamide gels [J]. Nature Protocols, 2007, 2(11): 2649-54.

[11]李冬, 劉麗倩, 吳迪, 等. 常溫低氨氮SBR亞硝化啟動策略研究 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2013, 33(2): 215-220.

[12]張昭, 李冬, 曾輝平, 等. 常溫下部分亞硝化的啟動中試研究 [J]. 中國給水排水, 2012, 28(17): 21-25.

[13]王淑瑩, 顧升波, 楊慶, 等. SBR工藝實時控制策略研究進展 [J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2009, 29(6): 1121-1130.

[14]張昭, 李冬, 邱文新, 等. 城市污水部分亞硝化的實現(xiàn)與穩(wěn)定運行 [J]. 中南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2013, 44(7): 3066-3071.

[15]鄭平, 徐向陽, 胡寶蘭. 新型生物脫氮理論與技術(shù) [M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2004.

[16]郭建華, 王淑瑩, 鄭雅楠, 等. 實時控制實現(xiàn)短程硝化過程中種群結(jié)構(gòu)的演變 [J]. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2010, 42(8): 1259-1263.

[17]SINHA B, ANNACHHATRE A P. Assessment of partial nitrification reactor performance through microbial population shift using quinone profile, FISH and SEM [J]. Bioresource Technology, 2007, 98(18): 3602-3610.

[18]YOON D N, PARK S J, KIM S J, et al. Isolation, characterization, and abundance of filamentous members of caldilineae in activated sludge [J]. Journal of Microbiology, 2010, 48(3): 275-283.

[19]MALIK A, SAKAMOTO M, HANAZAKI S, et al. Coaggregation among nonflocculating bacteria isolated from activated sludge [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(10): 6056-6063.

[20]SPROER C, REICHENBACH H, STACKEBRANDT E. The correlation between morphological and phylogenetic classification of myxobacteria [J]. International Journal of Systematic Bacteriology, 1999, 49(3): 1255-1262.

(編輯劉彤)

Analysis of the functional bacteria community in partial nitrification reactor for low strength sewage treatment at ambient temperature

ZENG Taotao1, LI Dong2, ZENG Huiping2, ZHANG Zhao3, LI Xiangkun4, ZHANG Jie2,4

(1.Hunan Province Key Laboratory of Pollution Control and Resources Reuse Technology( University of South China), 421001 Hengyang, Hunan, China; 2.Key Laboratory of Beijing for Water Quality Science and Water Environment Recovery Engineering (Beijing University of Technology), 100124 Beijing, China; 3.Architectural Design Institute, China Academy of Building Research, 100013 Beijing, China; 4.State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment (Harbin Institute of Technology), 150090 Harbin, China)

Abstract:Partial nitrification (PN) process was successfully developed in a plug flow reactor fed with low strength sewage at ambient temperature (18-21.5 ℃). For better detecting the efficiency and mechanism of the partial nitrification process in the PN reactor, ammonia, nitrite, and nitrate were detected firstly, subsequentially the functional bacterial community in the reactor was also investigated at microbial level. The sludge microstructures were detected by scanning electron microscopy (SEM), and the microbial characteristics was studied via fluorescence in situ hybridization (FISH), denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), cloning and sequencing analyzing. The DO concentration was maintained between 0.1 to 0.6 mg/L, to enhance AOB competition superiority. After 80 days continuous operation, PN reactor achieved nitrite accumulation rate of 100% and effluent NO2--N to NH4+-N ratio achieved 1.11. SEM results showed that spherical bacteria were the predominant bacteria in partial nitrifying sludge. FISH results showed the proportion of AOB and NOB were 37.3% and 4.4%, respectively. Bacterial DGGE and sequencing results indicated that six dominant bacteria coexisting in the PN reactor, among which Nitrosomonas sp. were the main AOB species.Those multiple functional bacteria contributed to the nitrogen removal in PN reactor.

Keywords:partial nitrification; functional bacteria; ambient temperature; low strength sewage; ammonia oxidizing bacteria; nitrite oxidizing bacteria

中圖分類號:X172

文獻標(biāo)志碼:A

文章編號:0367-6234(2016)02-0076-06

通信作者:李冬，lidong2006@bjut.edu.cn.

作者簡介:曾濤濤(1985—)，男，博士，講師；

基金項目:國家自然科學(xué)基金(51408293);中國博士后基金面上項目(2014M562114);湖南省教育廳優(yōu)秀青年項目(14B154).

收稿日期:2015-01-27.

doi：10.11918/j.issn.0367-6234.2016.02.013

李冬(1976—)，女，教授，博士生導(dǎo)師;

張杰(1938—)，男，博士生導(dǎo)師，中國工程院院士.