宏　峰，曾淑媛，鐘碧青

廣東省博羅縣人民醫(yī)院藥劑科，廣東 惠州 516100

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Smac/DIABLO對(duì)胰腺癌SW1990細(xì)胞凋亡及化療敏感性的影響

宏峰，曾淑媛，鐘碧青

廣東省博羅縣人民醫(yī)院藥劑科，廣東 惠州 516100

[摘要]目的研究Smac/DIABLO與胰腺癌對(duì)TRAIL和吉西他濱化療敏感性的關(guān)系。方法構(gòu)建Flag-pc3.1-Smac外源表達(dá)質(zhì)粒，在SW1990細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SMAC，采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法檢測(cè)Smac mRNA水平；應(yīng)用Western免疫印跡法檢測(cè)caspase-3、caspase-9和Bcl-2蛋白水平；利用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染Flag-pc3.1-Smac和TRAIL、吉西他濱處理后SW1990細(xì)胞增殖能力的改變；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染Flag-pc3.1-Smac后SW1990細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果轉(zhuǎn)染Flag-pc3.1-Smac后，SW1990細(xì)胞中Smac mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組；MTT試驗(yàn)顯示，過(guò)表達(dá)Flag-pc3.1-Smac的SW1990細(xì)胞在1～5 d的培養(yǎng)期中490 nm處吸光值均低于對(duì)照組。結(jié)論Smac/DIABLO促進(jìn)胰腺癌SW1990細(xì)胞凋亡，并增加對(duì)TRAIL和吉西他濱的化療敏感性。

[關(guān)鍵詞]Smac/DIABLO；TRAIL；吉西他濱；胰腺癌；化療敏感性

0引言

胰腺癌是臨床中預(yù)后最差的惡性腫瘤之一，由于其癥狀不明顯而不易確診等原因，患者確診時(shí)多處于腫瘤晚期，對(duì)藥物、放化療等治療手段容易產(chǎn)生耐受性[1]。因此，研究提高胰腺癌化療敏感性的治療手段具有重要意義。第2個(gè)線粒體衍生的胱天蛋白酶激活劑(Second mitochondria-derived activator of caspase，Smac)或稱(chēng)低等電點(diǎn)IAP直接結(jié)合蛋白(Direct IAP-binding protein with low pl，DIABLO)在腫瘤組織中呈低表達(dá)，可通過(guò)線粒體凋亡通路和死亡受體凋亡通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[2]。研究表明，Smac/DIABLO與腫瘤耐藥機(jī)制的發(fā)生有關(guān)[3]，本文中主要研究Smac/DIABLO對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡以及對(duì)腫瘤壞死因子相關(guān)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)和吉西他濱(Gemcitabine，GEM)兩種藥物化療敏感性的影響。

1材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞采用加入10%小牛血清(美國(guó)Gibco公司)的DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，利用lipofectamineTM2000(上海吉瑪基因公司)轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2RNA與cDNA制備利用美國(guó)天根公司TRIzol總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，利用分光光度計(jì)測(cè)量260 nm和280 nm的吸光度值，RNA質(zhì)量需滿足A260/A280=1.8～2.1。根據(jù)公式RNA濃度=A260×稀釋倍數(shù)×0.04 μg/μL計(jì)算RNA濃度。利用美國(guó)天根公司M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3Flag-pc3.1-Smac質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)Smac/DIABLO基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增ORF全長(zhǎng)引物，SMAC-F：5′-GACTCGAG-GCCACCATGGCGGTTCCTATT-GCAC-3′，XhoⅠ酶切位點(diǎn)。SMAC-R：5′-GGCTGACAAGCTT-CCAATCCTCACGCAGGTAG-3′，HindⅢ 酶切位點(diǎn)。利用天根公司PCR MIX 試劑進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；保存于4 ℃。將回收產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，回收PCR產(chǎn)物，進(jìn)行酶切后，連接到Flag-pc3.1載體中，送上海生工公司測(cè)序。

1.4Real-time PCR檢測(cè)Smac/DIABLO mRNA表達(dá)量將SW1990細(xì)胞接種到35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后轉(zhuǎn)染Flag-pc3.1-Smac，以轉(zhuǎn)染Flag-pc3.1的細(xì)胞為對(duì)照。收集細(xì)胞，獲得cDNA后，根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(美國(guó)天根公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行real-time PCR實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增反應(yīng)條件為90 ℃ 5 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，重復(fù)45個(gè)循環(huán)；94 ℃ 5 s，60 ℃ 45 s，94 ℃ 5 s。數(shù)據(jù)利用2-△△t進(jìn)行計(jì)算。

1.5Western免疫印跡檢測(cè)蛋白水平表達(dá)將SW1990細(xì)胞接種到35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染Flag-pc3.1-Smac 和Flag-pc3.1為對(duì)照后培養(yǎng)24 h，PBS洗凈后收集細(xì)胞，利用細(xì)胞裂解液(美國(guó)天根公司)裂解細(xì)胞獲得蛋白樣品，利用Western免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)caspase-3、caspase-9和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平。caspase-3、caspase-9和Bcl-2抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa公司。

1.6MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力將SW1990細(xì)胞接種到2個(gè)35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)染Flag-pc3.1作為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染Flag-pc3.1-Smac為實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)16 h后，重新計(jì)數(shù)后接種到96孔板中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞。設(shè)置6組處理?xiàng)l件：①對(duì)照組細(xì)胞，不加任何藥物處理；②對(duì)照組細(xì)胞，加入1 μg/mL TRAIL；③對(duì)照組細(xì)胞，加入60 μmol/L吉西他濱；④實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，不加任何藥物處理；⑤實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，加入1 μg/mL TRAIL；⑥實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，加入60 μmol/L吉西他濱。TRAIL和吉西他濱均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，每組設(shè)置4孔平行樣。分別培養(yǎng) 1～5 d。每天每孔加入10 μL MTT溶液，于5% CO2、37 ℃孵育4 h后加入150 μL二甲基亞砜進(jìn)行溶解，用酶標(biāo)儀震蕩模式震蕩搖勻10 min，檢測(cè)490 nm處各孔的吸光度，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況將SW1990細(xì)胞接種到35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染Flag-pc3.1-Smac和Flag-pc3.1后培養(yǎng)24 h，分別加入1 μg/mL TRAIL和 60 μmol/L吉西他濱處理24 h，PBS洗凈后加入80%預(yù)冷乙醇，置于-20 ℃冰箱固定過(guò)夜。用0.25%的TritonX-100 處理5 min，隨后PBS洗3次。加入10 μg/mL Annex V、10 μg/mL PI和0.1% RNase A在室溫下染色20 min，用FACSort流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Smac/DIABLO mRNA 表達(dá)水平將構(gòu)建并測(cè)序正確的Flag-pc3.1-Smac質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到SW1990細(xì)胞中，以轉(zhuǎn)入Flag-pc3.1空載的SW1990為對(duì)照，利用real-time PCR檢測(cè)Smac/DIABLO mRNA 表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，在外源轉(zhuǎn)染Flag-pc3.1-Smac的細(xì)胞中，Smac/DIABLO mRNA水平是對(duì)照組的1.92倍(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1　Smac/DIABLO相對(duì)表達(dá)量

2.2Smac/DIABLO、caspase-3、caspase-9和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平Western blotting 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以轉(zhuǎn)入Flag-pc3.1空載的SW1990為對(duì)照，在外源表達(dá)Flag-pc3.1-Smac的SW1990細(xì)胞中，Smac/DIABLO、caspase-3、caspase-9蛋白水平高于對(duì)照組，而B(niǎo)cl-2蛋白水平低于對(duì)照組。見(jiàn)圖2。

2.3Smac/DIABLO合并TRAIL和吉西他濱對(duì)胰腺癌增殖能力的影響利用MTT實(shí)驗(yàn)研究不同處理?xiàng)l件下細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Smac/DIABLO后SW1990細(xì)胞增殖能力低于對(duì)照組，與對(duì)照組相比，加入TRAIL和吉西他濱處理后得到同樣結(jié)果，合并Smac/DIABLO和TRAIL處理的SW1990細(xì)胞增殖能力低于對(duì)照組和單獨(dú)轉(zhuǎn)染Smac/DIABLO組，也低于單獨(dú)TRAIL處理組。單獨(dú)轉(zhuǎn)染SW1990細(xì)胞的增殖能力高于合并Smac/DIABLO和吉西他濱處理的SW1990細(xì)胞，單獨(dú)吉西他濱處理組細(xì)胞的增殖能力高于合并Smac/DIABLO和吉西他濱處理的SW1990細(xì)胞。見(jiàn)圖3。

圖2　Smac/DIABLO、caspase-3、caspase-9和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平

圖3　SW1990細(xì)胞在490 nm處吸光值

2.4Smac/DIABLO合并TRAIL和吉西他濱對(duì)SW1990細(xì)胞凋亡的影響利用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估不同處理?xiàng)l件對(duì)SW1990細(xì)胞凋亡情況的影響，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Smac/DIABLO顯著增加凋亡和壞死細(xì)胞的數(shù)目。單獨(dú)加入TRAIL和吉西他濱也可造成凋亡和壞死的SW1990細(xì)胞數(shù)目增多，但是Smac/DIABLO合并TRAIL或吉西他濱時(shí)，SW1990細(xì)胞凋亡數(shù)目高于單獨(dú)使用TRAIL和吉西他濱。見(jiàn)圖4。

3討論

Smac/DIABLO是參與線粒體凋亡通路和死亡受體凋亡通路、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的重要抑癌因子之一，在胰腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、膀胱癌等多種癌癥中表達(dá)下調(diào)[4-5]。Smac/DIABLO主要存在于線粒體膜間隙，在凋亡刺激下釋放到細(xì)胞質(zhì)，通過(guò)抑制凋亡抑制蛋白(Inhibitors of apoptosis proteins，IAPs)發(fā)揮作用。IAPs成員在多種癌細(xì)胞中高表達(dá)，如XIAP、C-IAP1、C-IAP2及Survivin等。IAPs結(jié)構(gòu)域中保守的RING指結(jié)構(gòu)域，通過(guò)結(jié)合并泛素化降解caspase家族蛋白達(dá)到抗凋亡目的。Smac/DIABLO可以與幾乎全部的IAPs蛋白結(jié)合，繼而解除IAPs對(duì)caspase家族蛋白(如caspase-3、caspase-9)的抑制作用，抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[6-7]。此外，Smac/DIABLO也與調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、分期和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[8]。

圖4　不同處理?xiàng)l件對(duì)SW1990細(xì)胞凋亡的影響

本研究構(gòu)建了Flag-pc3.1-Smac外源表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)在胰腺癌SW1990細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Smac/DIABLO，研究Smac/DIABLO在SW1990細(xì)胞中的功能。通過(guò)real-time PCR和Western blotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外源轉(zhuǎn)染Flag-pc3.1-Smac質(zhì)粒后，SW1990細(xì)胞中Smac/DIABLO的mRNA 和蛋白水平均有所增加。通過(guò)檢測(cè)Smac/DIABLO下游與凋亡相關(guān)凋亡因子caspase-3、caspase-9和Bcl-2的蛋白水平發(fā)現(xiàn)，Smac/DIABLO水平升高引起caspase-3和caspase-9蛋白水平的提高，同時(shí)下調(diào)Bcl-2的蛋白水平，說(shuō)明Smac/DIABLO通過(guò)caspase通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Smac/DIABLO后，SW1990細(xì)胞的增殖能力明顯降低，細(xì)胞凋亡比例增加，說(shuō)明過(guò)表達(dá)Smac/DIABLO可促進(jìn)SW1990細(xì)胞凋亡。

癌癥治療面臨的最大的難題之一即化療耐藥性，由耐藥性產(chǎn)生機(jī)制十分復(fù)雜，目前仍沒(méi)有完整的理論解釋。研究表明，化療耐藥性的產(chǎn)生可能是由于細(xì)胞響應(yīng)藥物誘導(dǎo)的凋亡通路異常造成的，促凋亡因子與抗凋亡因子的協(xié)調(diào)是解決化療耐藥性的關(guān)鍵。目前臨床中治療胰腺癌的主要化療藥物是二氟核苷類(lèi)抗代謝抗癌藥物吉西他濱，其通過(guò)抑制脫氧核苷酸的生成抑制DNA合成與修復(fù)，達(dá)到抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的目的。但是吉西他濱的抑制作用具有較高的非特異性，對(duì)患者的毒副作用較大，晚期胰腺癌患者對(duì)其耐藥性較高[9]。

TRAIL屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族，參與介導(dǎo)外源性凋亡通路的激活，誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡。目前TRAIL已經(jīng)作為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物完成了Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示，TRAIL是一種安全有效的選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)殺傷性[10]。但是一些研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、胰腺癌等細(xì)胞中對(duì)TRAIL治療存在耐受性，可能是由于下游caspase家族成員的異常表達(dá)，或者通過(guò)死亡受體DR4/DR5激活Bcl-2表達(dá)造成的[11]。在抗癌藥物、電離輻射、化學(xué)信號(hào)和DNA損傷等外界凋亡刺激下，線粒體中Smac/DIABLO伴隨著細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)中，發(fā)揮促凋亡功能。研究顯示，在惡性膠質(zhì)瘤中，Smac/DIABLO可以提高癌細(xì)胞對(duì)TRAIL和順鉑的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高其治療效果[12]。

MTT顯示，單獨(dú)加入TRAIL和吉西他濱均具有抑制SW1990細(xì)胞增殖的能力，在過(guò)表達(dá)Smac/DIABLO的細(xì)胞中合并使用TRAIL或吉西他濱處理時(shí)，細(xì)胞增殖能力進(jìn)一步降低。在流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)加入TRAIL和吉西他濱均具有促進(jìn)SW1990細(xì)胞凋亡和壞死的功能，過(guò)表達(dá)Smac/DIABLO且合并使用TRAIL或吉西他濱處理時(shí)，細(xì)胞凋亡程度進(jìn)一步增加，這說(shuō)明Smac/DIABLO可以降低SW1990細(xì)胞對(duì)TRAIL或吉西他濱的耐藥性，提高TRAIL和吉西他濱的治療效果。

總之，在研究Smac/DIABLO過(guò)表達(dá)對(duì)SW1990細(xì)胞的影響以及對(duì)TRAIL或吉西他濱藥敏性的影響中發(fā)現(xiàn)，Smac/DIABLO可以促進(jìn)SW1990細(xì)胞凋亡，提高對(duì)TRAIL或吉西他濱的藥物敏感性，這對(duì)臨床治療中減少化療藥物的使用劑量和毒性、增強(qiáng)治療效果具有重要意義。

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Effect of Smac/DIABLO on the apoptosis and chemotherapy sensitivity of SW1990 cells of pancreatic cancerHONG Feng,ZENG Shu-yuan,ZHONG Bi-qing (Department of Pharmacy,Boluo County People′s Hospital,Huizhou 516100,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of Smac/DIABLO on the chemotherapy sensitivity of pancreas cancer to TRAIL and gemcitabine.MethodsReal-time PCR was used to analyze the expression of Smac in SW1990 cells transfected with control and Flag-pc3.1-Smac plasmids respectively. Western blotting was used to detect the levels of caspase-3,caspase-9 and Bcl-2 protein. MTT was used to evaluate the growth of cells. Flow cytometry was used to detect the apoptosis of SW1990 cells transfected with control and Flag-pc3.1-Smac plasmids respectively.ResultsThe mRNA and protein expression of Smac/DIABLO was higher in SW1990 cells transfected with Flag-pc3.1-Smac than that of control cells. SW1990 cells transfected with Flag-pc3.1-Smac had lower absorption at 490 nm than control SW1990 cells.ConclusionSmac/DIABLO promotes the apoptosis of pancreas cancer SW1990 cell and enhances the chemotherapy sensitivity to TRAIL and gemcitabine.

Key words：Smac/DIABLO;TRAIL;Gemcitabine;Pancreas cancer;Chemotherapy sensitivity

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201602003

收稿日期：2015-05-24