姜洪芳，白　雪，牛慧彥，何　平

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院老年病科，沈陽(yáng) 110004

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·論著·

西瑞香素對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響

姜洪芳，白雪，?；蹚纹?

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院老年病科，沈陽(yáng) 110004

[摘要]目的探討西瑞香素對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響。方法通過(guò)Transwell小室分析西瑞香素對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲能力的影響；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)西瑞香素對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移能力的影響；Western blotting檢測(cè)西瑞香素作用于A549細(xì)胞后MMP-2、MMP-9侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，西瑞香素對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力有抑制作用；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，西瑞香素對(duì)A549細(xì)胞遷移能力有抑制作用；Western blotting結(jié)果提示，西瑞香素抑制MMP-2、MMP-9侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)。隨著藥物濃度增加，MMP-2、MMP-9表達(dá)減少，具有劑量依賴性。結(jié)論西瑞香素對(duì)A549細(xì)胞體外侵襲及遷移有抑制作用，這種作用與抑制MMP-2、MMP-9表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]西瑞香素;肺癌A549細(xì)胞;侵襲；遷移

0引言

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力是惡性腫瘤的一個(gè)基本特征，臨床中許多腫瘤患者的根本死因并非是腫瘤原發(fā)病灶，而是由于腫瘤晚期的侵襲和轉(zhuǎn)移引起的。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是當(dāng)前腫瘤治療的一大難題。非小細(xì)胞肺癌發(fā)病率高，轉(zhuǎn)移早，大量國(guó)內(nèi)外研究均證實(shí)，導(dǎo)致肺癌患者最終死亡的首要原因是肺癌的侵襲性轉(zhuǎn)移[1]，這也是當(dāng)今肺癌治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

西瑞香素(Daphnoretin)是一種天然香豆素，是從瑞香科植物南嶺蕘花中提取出來(lái)的有效藥物成分[2]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外與之相關(guān)的藥理研究獲得了很大進(jìn)展，目前已有研究顯示,西瑞香素具有抗真菌[3]、抑制DNA合成[4]、激活蛋白激酶C[5-6]、抗乙型肝炎病毒[7]和呼吸道合胞體病毒(RSV)[8]等生物學(xué)活性。最近的研究發(fā)現(xiàn)，西瑞香素在抗腫瘤方面同樣具有顯著作用。有實(shí)驗(yàn)顯示，西瑞香素對(duì)白血病[9]、宮頸癌[10]、骨肉瘤細(xì)胞[11]有明顯的生長(zhǎng)抑制和促進(jìn)凋亡的作用，而我們的前期實(shí)驗(yàn)[12]已經(jīng)證實(shí)，西瑞香素可以抑制人肺腺癌A549細(xì)胞系增殖，其機(jī)制也可能和抑制增殖、誘導(dǎo)其凋亡有關(guān)。西瑞香素高效低毒的特點(diǎn)使其成為潛在的理想的抗腫瘤藥物。然而，西瑞香素在人類(lèi)肺腺癌細(xì)胞中對(duì)侵襲遷移的影響仍不清楚。

本研究應(yīng)用Transwell小室實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)西瑞香素對(duì)A549細(xì)胞株的體外侵襲和遷移能力的影響，同時(shí)檢測(cè)MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)，探討西瑞香素影響A549細(xì)胞株侵襲和遷移能力的機(jī)制。

1實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑人肺癌A549細(xì)胞來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物教研室，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。西瑞香素(分子量352.29，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所)20 mg加入568 μL DMSO配制成100 mmol/L母液，過(guò)濾分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆?，工作液濃度按?shí)驗(yàn)需要臨用前配制。Transwell小室(Corning Costar Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室，美國(guó)，8 μm孔徑)，Matrigel膠購(gòu)于美國(guó)BD公司，MMP-2及MMP-9抗體購(gòu)于美國(guó) Santa Cruz 公司。倒置顯微鏡、穩(wěn)壓穩(wěn)流型電泳儀、電泳槽、成像分析照相系統(tǒng)均為我院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人肺癌A549細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶瓶底(一般2～3 d)后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，無(wú)菌條件下用0.25%的胰酶消化傳代。

1.3Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)Matrigel 膠50 μL包被 Transwell 小室上層，將小室置于24孔板內(nèi)，37 ℃放置3 h，超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干 4 h。微孔濾膜用PBS在37 ℃平衡2 h備用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞以無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL，取 200 μL 懸液加入 Transwell 小室的上室，處理組分別加入用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的西瑞香素50 μL，使終濃度分別為 10、20 μmol/L，對(duì)照組加入不含藥物的細(xì)胞懸液50 μL。在下層小室加入 500 μL 20%血清濃度1640培養(yǎng)液作為趨化。細(xì)胞于37 ℃、5%CO2溫箱中孵育 24 h。取出 Transwell 小室，PBS 淋洗，用酒精棉擦去微孔膜上層的Matrigel 凝膠和未穿膜的細(xì)胞。固定、吉姆薩染色后，在倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，高倍鏡下分別計(jì)數(shù)5個(gè)視野的移至微孔膜下層的細(xì)胞。穿膜細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)相比作為評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞侵襲能力強(qiáng)弱的指標(biāo)。

1.4劃痕實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)人肺癌A549細(xì)胞，以1×105/mL的濃度接種于6孔板，每孔接種1 mL。待細(xì)胞90%融合以后，用微量移液器Tip(規(guī)格為200 μL)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行劃痕損傷，每孔劃痕1次，寬度和長(zhǎng)度控制在1 mm×10 mm左右。用無(wú)血清培養(yǎng)基輕輕吹打劃痕附近，吸去培養(yǎng)基，反復(fù)3次，盡量將刮掉的細(xì)胞沖洗干凈。處理組分別加入用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的西瑞香素2 mL，使終濃度分別為 10、20 μmol/L，對(duì)照組加入不含藥物的細(xì)胞懸液2 mL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)0、24 h將6孔培養(yǎng)板放在倒置顯微鏡下(10×10倍)觀察劃痕周?chē)?xì)胞向損傷區(qū)的遷移情況，照相并測(cè)量劃痕區(qū)匯合度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5Western blotting檢測(cè)MMP-2、MMP-9相關(guān)蛋白表達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中過(guò)夜，并加入終濃度為0、10、20 μmol/L的西瑞香素溶液，采用加等量RPMI-1640培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，置5%CO2的飽和濕度37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h后，冰上裂解30 min，提取總蛋白。通過(guò)BCA法測(cè)定蛋白濃度，行SDS-PAGE電泳，其中一抗MMP-2、MMP-9、GAPDH 1∶200稀釋，加入1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的相應(yīng)二抗，常溫2 h，TBST漂洗PVDF膜3次。參照碧云天公司ECL試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行顯色反應(yīng)。曝光1～8 min，一次性完成定影、顯形、圖像分析系統(tǒng)測(cè)定條帶的光密度值。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1西瑞香素對(duì)A549細(xì)胞體外侵襲能力的影響應(yīng)用Transwell小室檢測(cè)西瑞香素對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲能力的影響,見(jiàn)圖1、圖2。

由圖1、圖2可見(jiàn)，加入Matrigel 膠后，發(fā)現(xiàn)西瑞香素處理后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的侵襲能力明顯降低，穿過(guò)Transwell小室膜的細(xì)胞隨藥物濃度的增加逐漸減少。

圖1　西瑞香素對(duì)A549細(xì)胞體外侵襲能力的影響(200×)

圖2　西瑞香素對(duì)A549細(xì)胞體外侵襲能力的影響

2.2西瑞香素對(duì)A549細(xì)胞體外遷移能力的影響應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)西瑞香素對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移能力的影響，發(fā)現(xiàn)西瑞香素處理后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移能力降低，細(xì)胞匯合度相比對(duì)照組隨藥物濃度的增加逐漸減小。見(jiàn)圖3、圖4。

2.3西瑞香素對(duì)A549細(xì)胞MMP-2 及MMP-9 蛋白表達(dá)的影響采用Western blotting方法檢測(cè)西瑞香素對(duì)A549細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白的影響。隨藥物濃度增加，MMP-2、MMP-9表達(dá)減少。見(jiàn)圖5。

圖3　西瑞香素對(duì)A549細(xì)胞體外遷移能力的影響(100×)

圖4　西瑞香素對(duì)A549細(xì)胞體外遷移能力的影響

3討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特征，腫瘤的惡性程度越高，其發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的可能越大。腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移是一個(gè)十分復(fù)雜的動(dòng)態(tài)的連續(xù)的生物學(xué)過(guò)程，由多個(gè)相對(duì)獨(dú)立的步驟組成。首先腫瘤細(xì)胞分泌蛋白降解酶類(lèi)降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，形成腫瘤細(xì)胞遷移通道，同時(shí)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)，穿透細(xì)胞外基質(zhì)及血管基底膜進(jìn)入循環(huán)，逃避免疫系統(tǒng)識(shí)別與破壞，到達(dá)繼發(fā)部位后，在新生血管形成的前提下增殖并形成轉(zhuǎn)移灶[13]。因此,肺癌細(xì)胞能否突破細(xì)胞外基質(zhì)是肺癌細(xì)胞局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。

圖5　西瑞香素對(duì)MMP-2 及MMP-9 蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的網(wǎng)狀物包括膠原蛋白、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白。人工構(gòu)建基底膜材料Matrigel是從EHS小鼠肉瘤中提取的，其主要成分：層粘連蛋白，Ⅳ型膠原蛋白，巢蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白，纖維原蛋白生長(zhǎng)因子，組織血纖維蛋白溶酶原激活劑和其他生長(zhǎng)因子。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)利用Matrigel膠模擬細(xì)胞外基質(zhì)，形成腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的天然屏障。腫瘤從原位增殖到浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的演進(jìn)過(guò)程中，必須具備降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力。侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，西瑞香素處理后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的侵襲能力明顯降低，穿過(guò)Transwell小室膜的細(xì)胞隨藥物濃度的增加逐漸減少。

腫瘤細(xì)胞降解基底膜結(jié)束，游離細(xì)胞向周?chē)巫哌w移是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程的另一個(gè)重要環(huán)節(jié)，我們使用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)?zāi)M這一環(huán)節(jié)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是一種操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的研究腫瘤細(xì)胞遷移能力的體外試驗(yàn)方法，在一定程度上模擬了體內(nèi)細(xì)胞遷移的過(guò)程。腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力與其運(yùn)動(dòng)能力密切相關(guān)。劃痕實(shí)驗(yàn)從形態(tài)學(xué)方面反映了西瑞香素對(duì)A549 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的抑制效果，跨過(guò)劃痕的細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比明顯減少。

基質(zhì)金屬蛋白酶在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移方面起到重要作用，它通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤擴(kuò)散。抑制MMP活性是肺癌治療的又一新靶點(diǎn)，其中MMP-2和MMP-9是降解Ⅳ型膠原最主要的蛋白酶，在腫瘤血管形成、腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移灶的形成中起重要作用[14]。目前，大量國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果均證實(shí)，MMP-2、MMP-9 與肺癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[15-17]。Suzuki 等[18]運(yùn)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè) MMP-2 和 MMP-9 在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)，結(jié)果提示，兩者在非小細(xì)胞肺癌中均有高表達(dá)。Peng 等[19]分析研究了17篇論文的2 029例非小細(xì)胞肺癌，結(jié)果表明，MMP-2、MMP-9過(guò)高表達(dá)和非小細(xì)胞肺癌患者的轉(zhuǎn)歸及預(yù)后不良相關(guān)。薛洋等[20]應(yīng)用 ELISA 的方法檢測(cè)了 19 例肺部良性病變及108 例非小細(xì)胞肺癌組織中的MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌組織中MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)水平高于癌旁肺組織和肺良性病變組織，同時(shí)伴有淋巴結(jié)和(或)遠(yuǎn)外轉(zhuǎn)移的肺癌中MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平高于不伴有淋巴結(jié)和(或)遠(yuǎn)外轉(zhuǎn)移的肺癌。從而推測(cè)非小細(xì)胞肺癌組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平可顯著升高，而且與非小細(xì)胞肺癌的病情進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果提示，西瑞香素可以抑制A549細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達(dá)，且呈劑量依賴性。

綜上所述，西瑞香素對(duì)A549細(xì)胞體外侵襲及遷移有抑制作用，這種作用與可能與抑制MMP-2、MMP-9表達(dá)有關(guān)，這為西瑞香素成為潛在的治療肺癌的理想藥物提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

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Effects of daphnoretin on invasion and migration of A549 lung cancer cellsJIANG Hong-fang，BAI Xue，NIU Hui-yan，HE Ping*( Department of Geriatrics，Shengjing Hospital of China Medical University，Shenyang 110004,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of daphnoretin on the proliferation and invasion of A549 lung cancer cells.MethodsThe effects of daphnoretin on the invasion of lung cancer A549 cells was detected by transwell assays and the effects of daphnoretin on the metastasis of lung cancer A549 cells was detected by Wound Healing.The expression of MMP-2，MMP-9 was evaluated by Western blotting on A549 with daphnoretin.ResultsDaphnoretin was effective in inhibiting the invasion and migration of A549 cells.Western blotting analysis revealed that daphnoretin decreased the protein levels of MMP-2,MMP-9 in a dose-dependent manner.ConclusionDaphnoretin inhibited the invasion and metastasis of lung cancer cell line A549 by regulating the expression of MMP-2 and MMP-9.

Key words：Daphnoretin;A549 human lung cancer cells;Invasion;Migration

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201602001

*通信作者

收稿日期：2015-10-15