譚玉婷，魯衛(wèi)星，趙俊男

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029；2 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院

譚玉婷1，魯衛(wèi)星2△，趙俊男1

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029；2 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院

目的：觀察龍牙木總皂苷、MitoKATP激活劑二氮嗪(DZ)、MitoKATP抑制劑5-羥基癸酸(5-HD)、龍牙+5-HD對(duì)大鼠缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)心肌線粒體細(xì)胞色素C和膜電位的影響，并探討龍牙木總皂苷在減輕MIRI中的作用及其機(jī)制。方法：將60只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(假手術(shù)組)、模型組、DZ組、5-HD組、龍牙組和龍牙+5-HD組，每組10只，建立Langendorff離體心臟灌流模型。對(duì)照組只穿線不結(jié)扎，以改良K-H液持續(xù)平衡灌流105分鐘；其余5組均穿線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈停灌30分鐘，再分別以改良K-H液、DZ、5-HD、龍牙木總皂苷、龍牙+ 5-HD復(fù)灌75分鐘(其中龍牙+ 5-HD組以5-HD復(fù)灌15分鐘繼以龍牙木總皂苷復(fù)灌60分鐘)。提取線粒體，western-blot半定量測(cè)定線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C水平，熒光酶標(biāo)儀測(cè)線粒體膜電位。結(jié)果：龍牙組線粒體細(xì)胞色素C釋放減少，膜電位較高，與模型組、5-HD組、龍牙+ 5-HD組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與DZ組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論：龍牙木總皂苷在MIRI時(shí)起到保護(hù)作用，能減少M(fèi)IRI時(shí)細(xì)胞色素C的釋放，穩(wěn)定線粒體膜電位，其作用可能與mitoKATP的開(kāi)放有關(guān)。

龍牙木總皂苷；缺血再灌注損傷；線粒體；細(xì)胞色素C；膜電位

近年來(lái)冠心病(CHD)發(fā)病人數(shù)日漸增多，急性心肌梗死(AMI)患者呈多發(fā)、高危、集中的趨勢(shì)，在臨床上也常以AMI的死亡率來(lái)代表冠心病的死亡率。隨著溶栓療法、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療、冠脈搭橋、心肺腦復(fù)蘇、心臟外科體外循環(huán)等治療手段在心血管疾病治療中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，如何防治缺血再灌注損傷(IRI)成為臨床常見(jiàn)問(wèn)題。線粒體是細(xì)胞進(jìn)行氧化磷酸化反應(yīng)的主要場(chǎng)所，同時(shí)也是心肌能量供應(yīng)場(chǎng)所，在維持鈣穩(wěn)態(tài)的平衡、調(diào)控膜電位、抑制細(xì)胞凋亡、進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)信息傳遞等方面發(fā)揮重要的作用，線粒體結(jié)構(gòu)和功能的變化是IRI發(fā)生和發(fā)展的重要因素。線粒體內(nèi)膜上存在ATP敏感性鉀通道 (MitoKATP)，MitoKATP是一種受細(xì)胞內(nèi)ATP調(diào)控，對(duì)K+高度通透的(聚)多亞基蛋白復(fù)合體［1］，對(duì)生物膜的穩(wěn)定性、線粒體及心肌細(xì)胞正常功能的維持都有非常重要的作用。研究表明，MitoKATP是IRI防治的重要靶點(diǎn)，開(kāi)放MitoKATP對(duì)缺血再灌注損傷心肌有保護(hù)作用。細(xì)胞色素C是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，釋放到胞質(zhì)后觸發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡［2］。膜電位是評(píng)價(jià)線粒體的重要指標(biāo)，反映線粒體的功能。龍牙楤木總皂苷為五加科植物，味辛性平有小毒，具有補(bǔ)氣安神，強(qiáng)精滋腎，祛風(fēng)除濕，活血止痛，健胃利水之功，現(xiàn)代藥理研究表明其有抗心肌缺血的作用［3］。本文通過(guò)測(cè)定大鼠缺血再灌注損傷(MIRI)心肌細(xì)胞線粒體中細(xì)胞色素C的相對(duì)表達(dá)量及線粒體膜電位，探討龍牙楤木總皂苷在MIRI中的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性Wistar大鼠60只，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2009-0007。

1.2 試劑 線粒體-胞漿蛋白制備試劑盒(C1260)、RIPA裂解緩沖液(C1053)、蛋白酶抑制劑混合物(P1265)、BCA法蛋白定量試劑盒(P1511)、5×SDS-PAGE非還原性蛋白上樣緩沖液(B1030)、1M Tris-Hcl PH6.8(B1002)、1M Tris-Hcl PH8.0 (B1011)、ImBlotter-NC硝酸纖維素膜(P2115)、Super ECL超敏發(fā)光液(P1020)、柯達(dá)X光膠片(E1112)均購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；山羊抗小鼠IgG、5×上樣緩沖液、10×電泳緩沖液、10×TBST 均購(gòu)自北京賽諾博公司；Cytochrome C (SC-13156)、DAB顯色試劑盒(9017)，購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；線粒體內(nèi)參COX IV (A01060)，購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司；彩色預(yù)染超低分子蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(AR1117)，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清白蛋白BSA(0332)，購(gòu)自Amresco；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)購(gòu)自北京泛博生物化學(xué)有限公司。

1.3 儀器 Langendorff，AD Instruments Pty Ltd實(shí)驗(yàn)室，ML870B2 Langendorff System；恒溫水浴，LETIC公司；蠕動(dòng)泵，Gilson公司；多導(dǎo)生理儀(美國(guó)Biopac公司)；Fresco低溫冷凍離心機(jī)(Thermo公司)；全波長(zhǎng)酶掃描儀(Thermo公司)；濕轉(zhuǎn)電泳槽(Cavoy)；電泳儀(Bio-Rad)；37℃生化培育箱(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；水平脫色搖床、渦旋震蕩器，其林貝爾儀器制造有限公司；熒光分光光度計(jì)(Hitachi Limited公司)；核酸蛋白分析儀(Beckman Coulter公司)；電子顯微鏡(奧林巴斯公司)；保濕盒(協(xié)力塑料制品廠)；石蠟切片機(jī)、自動(dòng)封片機(jī)，Leica公司；手持電動(dòng)勻漿器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；10、200 μL、1 mL移液槍(Eppendorf)；電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為6組，分別為對(duì)照組、模型組、DZ組、5-HD組、龍牙組和龍牙+ 5-HD組，每組10只。

1.4.2 動(dòng)物模型制備 建立Langendorff離體心臟灌流模型。將大鼠稱重，1×103U/kg腹腔注射肝素，充分肝素化后按1 mg/kg腹腔注射戊巴比妥麻醉。動(dòng)物固定，開(kāi)胸暴露主動(dòng)脈弓，鑷子夾緊主動(dòng)脈弓分支前，剪斷主動(dòng)脈，將取下的心臟放入預(yù)冷的K-H液中去血。提著主動(dòng)脈斷端插入Langendorff灌注管中，0號(hào)線固定心臟，逆行灌入含有95% O2和CO2的37℃K-H液平衡20分鐘(流速為10 mL/min)。剪開(kāi)右心耳流出灌流液，剪開(kāi)左心耳，破開(kāi)二尖瓣，將心室內(nèi)壓球囊放入左心室，壓力感受器連接多導(dǎo)生理儀，記錄心臟電生理活動(dòng)。入組標(biāo)準(zhǔn)為：心律齊，心率≥220次/min，左室收縮壓≥60 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)［4］。對(duì)照組：只穿線不結(jié)扎，以改良K-H液持續(xù)平衡灌流105分鐘。模型組：穿線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支近分支處停灌30分鐘，K-H液復(fù)灌75分鐘。DZ組：穿線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支近分支處停灌30分鐘，以含50 μmol/L二氮嗪的K-H液復(fù)灌75分鐘。5-HD組：穿線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支近分支處停灌30分鐘，以含100 μmol/L 5-HD的K-H液復(fù)灌75分鐘。龍牙組：穿線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支近分支處停灌30分鐘，以含5 mg/L龍牙楤木總皂苷的K-H液復(fù)灌75分鐘。龍牙+5-HD組：穿線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支近分支處停灌30分鐘，先予含100 μmol/L 5-HD的K-H液復(fù)灌15分鐘，再以含5 mg/L龍牙楤木總皂苷的K-H液復(fù)灌60分鐘。

1.4.3 線粒體內(nèi)蛋白的提取 從液氮罐中取出凍存的心肌組織，稱重后放在平皿內(nèi)，迅速在冰上將其剪成碎塊，放入預(yù)冷的玻璃勻漿器中。加入1.5 mL預(yù)冷的mito solution，在冰水浴中上下研磨20次左右至漿液狀，將其移入離心管中。4℃離心機(jī)離心5分鐘。棄沉淀，上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。4℃離心機(jī)再次離心5分鐘，棄去沉淀，上清轉(zhuǎn)移到新的離心管。4℃離心機(jī)離心10分鐘，上清為胞漿成分，沉淀即為線粒體。沉淀中加200 μLmito solution，渦旋震蕩，4℃離心機(jī)離心10 分鐘進(jìn)行線粒體的洗滌，棄去上清，沉淀為洗滌后的線粒體。沉淀中加入100 μL RIPA裂解緩沖液，渦旋震蕩，冰水浴中靜置10分鐘，4℃離心機(jī)離心10分鐘，上清為裂解的線粒體，吸取分裝。

1.4.4 蛋白定量 (BCA法) 將標(biāo)準(zhǔn)蛋白倍比稀釋，線粒體蛋白進(jìn)行10倍稀釋。BCA Reagent與Cu Reagent 50∶1混合配成工作液。96孔板中加入工作液和標(biāo)準(zhǔn)品、樣品，37℃反應(yīng)30分鐘。放入酶標(biāo)儀中，測(cè)570 nm的光密度(OD)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品的實(shí)際蛋白濃度(mg/mL)。

1.4.5 western-blot半定量測(cè)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C 配15%分離膠和5%濃縮膠，線粒體蛋白上樣。電泳恒壓100 mV，跑至濃縮膠和分離膠之間改為恒壓170 mV，繼續(xù)電泳時(shí)間約1小時(shí)。恒流300 mA轉(zhuǎn)膜1小時(shí)，轉(zhuǎn)膜完成后麗春紅染色試劑對(duì)膜進(jìn)行染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果。洗去麗春紅染液，將膜完全浸沒(méi)在3%BSA-TBST中，室溫輕搖30分鐘進(jìn)行封閉。孵育一抗，一抗(Cytochrome C)稀釋滴度為1∶40 000(線粒體)，線粒體內(nèi)參COX IV(鼠單抗)稀釋滴度為1∶5 000。室溫孵育10分鐘，放4℃過(guò)夜。第2天從4℃拿出膜，TBST洗5次，10 min/次。5%脫脂奶粉-TBST稀釋二抗(山羊抗鼠IgG，HRP標(biāo)記)，二抗稀釋滴度為1∶10 000，孵育1小時(shí)。

TBST洗膜6次，5 min/次。ECL顯影，光密度掃描定量分析。

1.4.6 線粒體膜電位的測(cè)定 應(yīng)用上海杰美基因提供的線粒體提取試劑盒提取純化線粒體。線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒 (JC-1)檢測(cè)線粒體膜電位：1)JC-1染色工作液(200×)在25℃水浴箱中完全溶解，按每50 μL加入8 mL超純水的比例稀釋JC-1，渦旋振蕩充分混勻，將配好的JC-1染色工作液用JC-1染色緩沖液5倍稀釋，冰槽靜置。2) 0.9 mLJC-1染色工作液加入0.1 mL總蛋白量為10～100 μg純化線粒體。3)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：檢測(cè)JC-1單體時(shí)將激發(fā)光設(shè)置為490 nm，發(fā)射光設(shè)置為530 nm。檢測(cè)JC-1聚合物時(shí)將激發(fā)光設(shè)置為525 nm，發(fā)射光設(shè)置為590 nm。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以表示，組間比較用單因素方差分析或秩和檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C表達(dá) 線粒體細(xì)胞色素C相對(duì)量模型組低于對(duì)照組、DZ組和龍牙組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；模型組高于5-HD組、龍牙+5-HD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；DZ組與龍牙組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。5-HD組與龍牙+ 5-HD組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1、圖1—2。

表1 線粒體和胞漿細(xì)胞色素C表達(dá)相對(duì)量

表1 線粒體和胞漿細(xì)胞色素C表達(dá)相對(duì)量

注：*表示與對(duì)照組比較，P＜0.05；△表示與模型組比較，P＜0.01；☆表示與模型組、DZ組、龍牙組比較，P＜0.01；●表示與DZ組比較，P＞0.05；▲表示與5-HD組比較，P＞0.05 (下同)。

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圖1 線粒體細(xì)胞色素C及內(nèi)參COXIV

圖2 線粒體細(xì)胞色素C相對(duì)表達(dá)量

2.2 線粒體膜電位 用綠紅熒光的相對(duì)比例衡量膜電位，激發(fā)光490 nm發(fā)射光530 nm得到的數(shù)值與激發(fā)光525 nm發(fā)射光590 nm得到的數(shù)值作一個(gè)相對(duì)值，數(shù)值越大，膜電位越低。結(jié)果顯示模型組膜電位明顯降低，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。DZ組、龍牙組膜電位有所下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。5-HD組、5龍組膜電位明顯降低，與模型組、DZ組、龍牙組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。DZ組與龍牙組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。5-HD組與5龍組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2、圖3。

表2 線粒體膜電位

表2 線粒體膜電位

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圖3 線粒體膜電位

3 討論

細(xì)胞色素C是呼吸鏈中傳遞電子的載體，它結(jié)合于線粒體內(nèi)膜的外側(cè)而不能通過(guò)外膜。國(guó)內(nèi)外的大量研究已證實(shí)MitoKATP在心肌缺血再灌注損傷中有重要的保護(hù)作用，抑制MitoKATP能夠促使線粒體膜電位崩潰和細(xì)胞色素C的釋放［3-6］。釋放到胞漿中的細(xì)胞色素C與細(xì)胞凋亡蛋白活化因子Apaf-1聚合，激活Caspase-9及Caspase-3，引起Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)［7］，引發(fā)細(xì)胞凋亡。楊?，帲?］通過(guò)建立大鼠在體缺血再灌注損傷模型并給予心肌缺血預(yù)處理，觀察細(xì)胞色素C的表達(dá)，得出細(xì)胞色素C與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，MitoKATP開(kāi)放劑二氮嗪能有效保護(hù)心肌缺血再灌注損傷。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)western-blot免疫印跡檢測(cè)線粒體中細(xì)胞色素C的相對(duì)含量，得出MIRI發(fā)生時(shí)，線粒體釋放細(xì)胞色素C到胞漿中，本來(lái)在胞漿中含量極少的細(xì)胞色素C增加，MitoKATP激活劑二氮嗪和龍牙楤木總皂苷能明顯減少細(xì)胞色素C的釋放，保護(hù)線粒體功能，減輕MIRI，但這種作用會(huì)被MitoKATP抑制劑所抑制。

線粒體跨膜電位(△Ψm)的形成是由位于線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子泵將線粒體內(nèi)的質(zhì)子泵到外室形成的，跨膜電位內(nèi)負(fù)外正。正常的跨膜電位是維持線粒體功能所必須的。當(dāng)MIRI發(fā)生時(shí)，氧自由基使線粒體膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，大量Ca2+進(jìn)入線粒體內(nèi)，激活磷脂酶進(jìn)一步損傷膜磷脂，線粒體膜通透性增加，膜內(nèi)外的電勢(shì)差下降，膜電位降低，線粒體正常功能受到嚴(yán)重?fù)p傷。Ozcan等［9］發(fā)現(xiàn)二氮嗪預(yù)處理后的缺血再灌注大鼠ROS明顯減少，這種作用能被MitoKATP抑制劑5-HD拮抗。Calderone等［10］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)MitoKATP開(kāi)放劑二氮嗪在心肌缺血再灌注大鼠能降低線粒體內(nèi)Ca2+的含量，這種作用與二氮嗪用量呈正相關(guān)。MitoKATP對(duì)跨膜電位的穩(wěn)定作用可能與減輕氧化應(yīng)激和鈣損傷有關(guān)。JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位的理想熒光探針，在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光，在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光，常用紅綠熒光的相對(duì)比例來(lái)衡量線粒體去極化的比例，從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明MIRI發(fā)生時(shí)，線粒體膜電位明顯下降，龍牙楤木總皂苷能減輕膜電位降低，穩(wěn)定線粒體膜，保護(hù)線粒體功能。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)龍牙楤木總皂苷能夠在MIRI起到保護(hù)作用，能減少M(fèi)IRI時(shí)細(xì)胞色素C的釋放，穩(wěn)定線粒體膜電位，其作用可能與MitoKATP的開(kāi)放有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為中醫(yī)藥防治缺血再灌注損傷提供了新的思路和方法，但仍有尚未解決的問(wèn)題有待繼續(xù)探索。

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Study of Effects and Function Mechanism of Aralosides on Mitochondrial Cytochrome C and Membrane Potential of IRI Rat Cardiac Muscle Cells

TAN Yuting1,LU Weixing2△,ZHAO Junnan1
1 Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China; 2 The Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine

Objective: To observe the effects of aralosides, MitoKATPDZX, MitoKATP5-HD, LongYa plus 5-HD on mitochondrial cytochrome C and membrane potential of IRI rat cardiac muscle cells, and explore the function and mechanism of aralosides on relieving MIRI. Methods: All 60 male wister rats were randomly divided into the control group( sham operation group), the model group, DZ group, 5-HD group, aralosides group, aralosides plus 5-HD group, each group 10 rats, Langendorff reperfusion model in isolated heart was built. The control group was given threading, not ligation, persistent and balanced perfusion by improved K-H liquid for 105 min. The other five groups were given threading and ligation for coronary artery, perfusion stopped for 30 min, then reperfusion by improved K-H liquid, DZ, 5-HD, aralosides and aralosides plus 5-HD for 75 min( the aralosides plus 5-HD group was reperfused for 15 min, also reperfused by aralosides for 60 min). Mitochondria were extracted, mitochondrial cytochrome C was measured by western-blot semiquantitative analysis. Mitochondrial membrane potential was measured by microplate system. Results: The release of mitochondrial cytochrome C in aralosides group reduced, membrane potential increased, compared with the control group, 5-HD group and aralosides plus 5-HD group, there were statistical differences(P＜0.05), compared with DZ group, there were no statistical differences(P＞0.05). Conclusion: Aralosides can protect MIRI, reduce the release of mitochondrial cytochrome C in MIRI, stabilize mitochondrial membrane potential, its function might be related to MitoKATPopen.

aralosides; IRI; mitochondria; cytochrome C; membrane potential

R285.5

A

1004-6852(2016)12-0009-04

2016-07-27

國(guó)家自然科學(xué)基金課題(編號(hào)81273691)。

譚玉婷(1988—)，女，在讀博士研究生。研究方向：心血管疾病的中西醫(yī)結(jié)合治療。

△通訊作者：魯衛(wèi)星(1959—)，男，碩士學(xué)位，教授，主任醫(yī)師。研究方向：心血管疾病的中西醫(yī)結(jié)合治療。