顏小捷，蔣周田，2，楊子明，鄭立浪，3，李典鵬，*（.廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣西植物研究所，廣西桂林54006；2.桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西桂林54006；3.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西桂林54004）

?

核桃多肽的制備及其體外抗氧化性研究

顏小捷1，蔣周田1，2，楊子明1，鄭立浪1，3，李典鵬1，*
（1.廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣西植物研究所，廣西桂林541006；2.桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西桂林541006；3.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西桂林541004）

摘要：以核桃蛋白為原料，以水解度為指標(biāo)，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了堿性蛋白酶酶解核桃蛋白制備抗氧化肽的工藝參數(shù)。得到堿性蛋白酶最佳酶解條件為酶添加量5 %，底物濃度3 %，酶解溫度55℃，酶解pH為9.0，酶解時(shí)間6 h；在各酶最佳條件下獲得的核桃多肽具有一定的抗氧化性。

關(guān)鍵詞：堿性蛋白酶；核桃蛋白；酶解；抗氧化

我國(guó)核桃資源非常豐富，已有研究表明，核桃油具有顯著降血脂和降動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)性的作用，而大量核桃仁榨油后的產(chǎn)物即核桃餅粕常被作為飲料或肥料，甚至作為廢棄物被丟棄[1-2]。研究表明核桃餅粕能明顯提高大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，改善大鼠的抗氧化功能，提高乙酰膽堿酯酶的活性，其分離蛋白酶解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制率[3-4]。有一定的溶血性和抑菌作用。近年來(lái)，對(duì)核桃餅粕的深加工已逐步開(kāi)展起來(lái)，主要是利用核桃餅粕制備核桃多肽[5]。

核桃蛋白酶解產(chǎn)物的水解度及其抗氧化活性受不同酶解方式的影響[6-8]。為了充分開(kāi)發(fā)利用核桃蛋白，對(duì)其進(jìn)行了多種酶酶解研究。課題組前期研究表明：木瓜蛋白酶水解核桃蛋白的最佳酶解條件為：酶添加量5 %、底物濃度4 %、酶解pH為7.0、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間4 h；在該條件下，木瓜蛋白酶酶解核桃蛋白水解度可高于25.76 %；植物蛋白水解專(zhuān)用酶1（以下簡(jiǎn)稱(chēng)：酶1）最佳酶解條件：酶添加量為0.5 %，底物濃度為11 %，酶解溫度為55℃，酶解時(shí)的pH為10.0，酶解時(shí)間為12 h；植物蛋白水解專(zhuān)用酶2（以下簡(jiǎn)稱(chēng)：酶2）最佳酶解條件：酶添加量為0.5 %，底物濃度為12 %，酶解溫度為50℃，酶解時(shí)的pH為9.0，酶解時(shí)間為14 h。在前期研究基礎(chǔ)上，本研究同時(shí)考察了堿性蛋白酶酶解核桃蛋白的最佳工藝參數(shù)，并進(jìn)一步考察了上述4種酶在最佳條件下酶解產(chǎn)物的體內(nèi)外抗氧化性研究。研究結(jié)果可為核桃多肽的制備及應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

核桃餅粕：購(gòu)自青島十相自在食品有限公司；堿性蛋白酶（酶活為200萬(wàn)U/g）：江蘇銳陽(yáng)生物科技有限責(zé)任公司；木瓜蛋白酶：南寧龐博生物工程有限公司；酶1、酶2（酶活均為30～40萬(wàn)U/g）：南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；鹽酸、氫氧化鈉、茚三酮、乙醇：西隴化工股份有限公司；DPPH：sigma公司；ABTS：南京奧多福尼生物科技有限公司；過(guò)硫酸鉀、甘氨酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；電子天平XS225A-SCS：Precisa；LG-500A十兩裝高速中藥粉碎機(jī)：浙江瑞安市百信藥機(jī)器械廠；CT-6023pH計(jì)：深圳市柯迪達(dá)電子有限公司；HH-S型水浴鍋：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；KQ 3200 DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RT-9100型半自動(dòng)生化分析儀：深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司。

1.2方法

1.2.1單因素及正交試驗(yàn)

首先，參照文獻(xiàn)提取核桃蛋白[9]，接著，以水解度為指標(biāo)，選用堿性蛋白酶，依次考察酶添加量、底物濃度、酶解pH、酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶酶解核桃蛋白的影響，選擇交互作用較大的三因素進(jìn)行三水平的正交試驗(yàn)，從而確定堿性蛋白酶酶解核桃蛋白的最佳酶解條件。

1.2.2蛋白質(zhì)含量測(cè)定

供試品溶液的制備：分別稱(chēng)取一定量的核桃蛋白，在木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、酶1和酶2的最佳酶解條件下酶解得到相應(yīng)酶解產(chǎn)物。各酶解產(chǎn)物冷凍干燥后，分別稱(chēng)取5 mg，用去離子水配制成1 mg/mL后4 000 r/min離心10 min取上清液待測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作及樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定：按BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒方法測(cè)定。

1.2.3 DPPH自由基清除率測(cè)定[10]

將上述供試品溶液用去離子水稀釋成一系列濃度，取0.5 mL樣品加入0.5 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液，搖勻置于37℃水浴30 min后測(cè)定517 nm處吸光度，每份樣品平行操作2次。DPPH清除率/%=[（A空白-A樣品）/A空白]×100，式中A空白為0.5 mL DPPH乙醇溶液與0.5mL去離子水混合后的吸光度，A樣品為0.5mL DPPH乙醇溶液與0.5 mL樣品混合后的吸光度。

1.2.4 ABTS測(cè)定[11]

2結(jié)果與分析

2.1酶添加量對(duì)酶解反應(yīng)的影響

酶添加量對(duì)酶解反應(yīng)的影響結(jié)果見(jiàn)圖1所示。

圖1酶添加量對(duì)核桃蛋白水解度的影響Fig.1 The ratio of enzyme and substrate quality on walnut protein hydrolysis

酶添加量（酶與底物質(zhì)量比）在1 %～7 %（核桃蛋白均為2.5 g，酶添加量分別為0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175 g，即酶活依次為5、10、15、20、25、30、35 U）范圍內(nèi)，隨堿性蛋白酶酶添加量的升高水解度呈先增大后減小趨勢(shì)，在4 %時(shí)取得最佳水解度為14.52 %。

2.2底物濃度對(duì)酶解反應(yīng)的影響

底物濃度對(duì)酶解反應(yīng)的影響結(jié)果見(jiàn)圖2所示。

圖2底物濃度對(duì)核桃蛋白水解度的影響Fig.2 The effect of substrate concentration on walnut protein hydrolysis degree

在一定范圍內(nèi)，堿性蛋白酶對(duì)核桃蛋白水解度隨底物濃度的升高呈波動(dòng)的趨勢(shì)，如圖，堿性蛋白酶在底物濃度不超過(guò)4 %時(shí)，隨著底物濃度增加，水解度逐漸增大，底物濃度超過(guò)4 %后，水解度呈下降趨勢(shì)，當(dāng)核桃蛋白濃度為4 %時(shí)，水解度最大為22.52 %。

2.3酶解pH對(duì)酶解反應(yīng)的影響

酶解pH對(duì)酶解反應(yīng)的影響結(jié)果見(jiàn)圖3所示。

圖3酶解pH對(duì)核桃蛋白水解度的影響Fig.3 The effect of enzyme solution pH on walnut protein hydrolysis

酶解pH在7.5～10范圍內(nèi)，隨反應(yīng)pH的升高水解度整體呈先增大后減小趨勢(shì)，pH為9是堿性蛋白酶酶解反應(yīng)較適宜pH，其水解度為12.23 %。

2.4酶解溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響

酶解溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響結(jié)果見(jiàn)圖4所示。

圖4酶解溫度對(duì)核桃蛋白水解度的影響Fig.4 The effect of enzyme solution temperature on the degree of walnut protein hydrolysis

55℃為堿性蛋白酶酶解反應(yīng)較適宜溫度，其水解度為11.14 %。

2.5酶解時(shí)間對(duì)酶解反應(yīng)的影響

酶解時(shí)間對(duì)酶解反應(yīng)的影響結(jié)果見(jiàn)圖5所示。

圖5酶解時(shí)間對(duì)核桃蛋白水解度的影響Fig.5 The effect of enzyme solution time on the degree of walnut protein hydrolysis

在一定條件下，堿性蛋白酶對(duì)核桃蛋白酶解隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì)，酶解最佳時(shí)間為6h，其水解度為12.05 %。

2.6堿性蛋白酶正交試驗(yàn)

堿性蛋白酶正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1，其試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1堿性蛋白酶正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and the level of Alcalase orthogonal test

表2堿性蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 The results and analysis of Alcalase orthogonal test

影響堿性蛋白酶酶解核桃蛋白水解度的各因素主次順序是：B﹥C﹥A，即酶添加量影響最大，酶解時(shí)間其次，底物濃度最小。另kA1≠kA2≠kA3說(shuō)明A因素的水平變動(dòng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有影響，由kA1>kA2>kA3可斷定A1為A因素的優(yōu)水平，同理B3和C2分別為B、C兩因素的優(yōu)水平。后經(jīng)3次試驗(yàn)驗(yàn)證表明：A1B3C2組水解度（平均水解度50.72 %）比A2B3C2（47.34 %）大，故堿性蛋白酶酶解核桃蛋白的最佳工藝條件為：A1B3C2，即底物濃度為3 %，酶添加量為5 %，酶解時(shí)間為6 h。

2.7蛋白質(zhì)含量測(cè)定

以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，以其吸光度值為縱坐標(biāo)，得蛋白質(zhì)含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并得到回歸方程y= 21.767x+0.001 8，R2=0.999 2。根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算核桃蛋白不同酶解物中蛋白質(zhì)含量結(jié)果見(jiàn)表3。

2.8 DPPH自由基清除率測(cè)定

將酶1、酶2、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物用去離子水稀釋成一系列濃度，按照DPPH方法測(cè)定A517，計(jì)算DPPH·清除率，結(jié)果見(jiàn)圖6。

表3不同酶解產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量Table 3 Different enzymic protein content in the product

圖6核桃多肽對(duì)DPPH·的清除作用Fig.6 Walnut polypeptide on DPPH·scavenging effect

其中，酶解物濃度對(duì)應(yīng)的DPPH·清除率為：酶1產(chǎn)物（569μg/mL）清除率為54.16%；酶2產(chǎn)物（509μg/mL）清除率為56.70 %；堿性蛋白酶產(chǎn)物（561 μg/mL）清除率為55.64 %；木瓜蛋白酶產(chǎn)物（513 μg/mL）清除率為69.88 %。

2.9 ABTS測(cè)定

移取1.2.2配制的酶1、酶2、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物待測(cè)液，按照ABTS方法測(cè)定A734，計(jì)算ABTS自由基清除率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4核桃多肽對(duì)ABTS自由基的清除作用Table 4 Walnut polypeptide on ABTS free radical removal effect

3結(jié)論與討論

以核桃蛋白為原料，以水解度為指標(biāo)，通過(guò)單因素的考察和正交試驗(yàn)的優(yōu)化，確定了堿性蛋白酶酶解核桃蛋白的最佳條件為：酶添加量5 %，底物濃度3 %，酶解pH為9.0，酶解溫度55℃，酶解時(shí)間6 h。酶1、酶2、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶在各自最佳酶解條件下獲得的核桃多肽產(chǎn)物，其可溶性蛋白質(zhì)含量差異較大，其中木瓜蛋白酶產(chǎn)物（67.21 %）﹥酶2產(chǎn)物（59.39 %）> 酶1產(chǎn)物（49.90 %）﹥堿性蛋白酶產(chǎn)物（47.13 %）；各產(chǎn)物對(duì)DPPH·和ABTS自由基具有一定的清除率，其中，對(duì)DPPH·清除率大小依次為：木瓜蛋白酶產(chǎn)物69.88 %（513 μg/mL），酶2產(chǎn)物56.70 %（509 μg/mL），堿性蛋白酶產(chǎn)物55.64 %（561 μg/mL），酶1產(chǎn)物54.16 %（569 μg/mL）；對(duì)ABTS自由基清除率大小依次為：酶2產(chǎn)物64.83 %（92.55 μg/mL），木瓜蛋白酶產(chǎn)物53.63 %（93.27 μg/mL），酶1產(chǎn)物53.49 % （103.45μg/mL），堿性蛋白酶產(chǎn)物49.85%（102.18μg/mL）。本研究發(fā)現(xiàn)，各酶解產(chǎn)物的抗氧化性大小與各自可溶性蛋白質(zhì)含量幾乎呈正相關(guān)關(guān)系；另在體內(nèi)抗氧化研究中，酶1產(chǎn)物呈現(xiàn)較強(qiáng)抗氧化性及其降血脂活性，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]賈立君,馬匯泉.核桃油綜合保質(zhì)技術(shù)研究[J].現(xiàn)代化農(nóng)業(yè),2013 (1): 40-41

[2]譚新蘭.國(guó)內(nèi)核桃綜合深加工開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀與前景[J].新疆農(nóng)機(jī)化, 2008(4): 20-21

[3]樊永波,陶興無(wú),馬琳,等.核桃餅粕對(duì)大鼠學(xué)習(xí)、記憶和抗氧化功能的影響[J].食品科學(xué),2013, 34(17): 323-326

[4]朱振寶,周慧江,易建華. Alcalase 2. 4L酶解核桃分離蛋白制備ACE抑制肽的工藝研究[J].中國(guó)油脂,2013, 38(2): 40-44

[5]徐懷德,陳金海,姜莉,等.一種核桃多肽粉的制作方法:中國(guó): CN101228918[P]. 2008-07-30

[6]呂瑩,楊柏崇,王瑩,等.預(yù)處理對(duì)核桃肽抗氧化活性的影響[J].食品工業(yè)科技,2013(2): 286-289

[7]范方宇,闞歡,許善午,等.中性蛋白酶水解核桃蛋白工藝[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2011, 32(11): 78-81

[8]宗玉霞,楊海燕,勞菲,等.木瓜蛋白酶水解核桃粕制備抗氧化活性多肽的研究[J].中國(guó)食品添加劑,2012(4): 170-176

[9]顏小捷,劉幼嫻,鄭立浪,等.胃蛋白酶和木瓜蛋白酶水解核桃蛋白工藝研究[J].廣西植物,2014, 34(2): 183-188

[10]胡喜蘭,韓照祥,陶瑩,等. DPPH法測(cè)定17種植物的抗氧化活性[J].食品科技,2006(10): 264-268

[11]李培源,霍麗妮,蘇煒,等.總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(ABTS)法測(cè)定江南星蕨的抗氧化活性[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(1): 162-164

Studies on the Preparation of Walnut Polypeptide and Its Antioxidant Activity in Vitro

YAN Xiao-jie1，JIANG Zhou-tian1，2，YANG Zi-ming1，ZHENG Li-lang1，3，LI Dian-peng1，*
（1. Guangxi Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization，Guangxi Institute of Botany，Guilin 541006，Guangxi，China；2. College of Chemistry and Bioengineering，Guilin University of Technology，Guilin 541006，Guangxi，China；3. College of Life Science，Guangxi Normal University，Guilin 541004，Guangxi，China）

Abstract：With walnut protein as raw materials and degree of hydrolysis as indicators，alcalase was optimized by single factor and orthogonal experiments to obtain the process parameters of prepare walnut antioxidant peptides. The optimal enzymolysis conditions were as follows：the ratio of enzyme and substrate quality was 5 %，substrate concentration was 3 %，enzymolysis temperature was 55℃，enzyme solution pH was 9.0，enzymolysis time was 6 h. Under the optimum conditions for enzymatic walnut polypeptides have obtained certain oxidation resistance.

Key words：alcalase；walnut protein；enzymatic hydrolysis；antioxidant

收稿日期：2014-09-18

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.010

*通信作者

作者簡(jiǎn)介：顏小捷（1985—），女（漢），助理研究員，碩士，主要從事植物資源開(kāi)發(fā)與利用研究。

基金項(xiàng)目：廣西植物研究所基本業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（桂置業(yè)13001和桂置業(yè)15011）