徐 艷，劉玉玲，嚴(yán)漢彬，伍德政

(1.河源職業(yè)技術(shù)學(xué)院機(jī)電工程學(xué)院，廣東河源 517000；2.汕頭大學(xué)理學(xué)院，廣東汕頭 515063；3.河源市環(huán)境保護(hù)技術(shù)中心，廣東河源 517000)

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一種纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選方法

徐 艷1，2，劉玉玲3，嚴(yán)漢彬1，伍德政1

(1.河源職業(yè)技術(shù)學(xué)院機(jī)電工程學(xué)院，廣東河源 517000；2.汕頭大學(xué)理學(xué)院，廣東汕頭 515063；3.河源市環(huán)境保護(hù)技術(shù)中心，廣東河源 517000)

摘要[目的]獲得一種簡(jiǎn)單高效的纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選方法。[方法]基于擴(kuò)散原理，采用濾紙條擴(kuò)散試驗(yàn)篩選纖維素酶產(chǎn)生菌。[結(jié)果]獲得2株纖維素酶產(chǎn)生菌菌株X1和X2。經(jīng)DNS法檢驗(yàn)，菌株X1的FPA酶和CMC酶活力分別為12.3和8.3 U，菌株X2的FPA酶和CMC酶活力分別為8.8和7.8 U。[結(jié)論]濾紙條擴(kuò)散試驗(yàn)可作為一種便捷高效的篩選高質(zhì)量纖維素酶產(chǎn)生菌的方法。

關(guān)鍵詞擴(kuò)散；纖維素酶；篩選

纖維素是葡萄糖分子通過(guò)β-1，4-糖苷鍵連接而成的直鏈多糖類物質(zhì)，是自然界含量最豐富的可再生資源[1-2]。纖維素酶是一類能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，目前廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)、食品工業(yè)、紡織工業(yè)以及能源工業(yè)，已成為酶工程研究的熱點(diǎn)[3-6]。

纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選是纖維素酶工業(yè)應(yīng)用的基礎(chǔ)。研究表明，纖維素酶工業(yè)生產(chǎn)的菌株一般是從環(huán)境中篩選，經(jīng)基因工程改造后的重組菌株[6-10]。傳統(tǒng)的纖維素酶產(chǎn)生菌篩選一般需經(jīng)過(guò)富集、初篩、復(fù)篩、純化等過(guò)程，篩選時(shí)間長(zhǎng)，程序繁瑣，且工作量大。為此，筆者設(shè)計(jì)了一種濾紙條擴(kuò)散試驗(yàn)，可在富集、初篩的基礎(chǔ)上，初步得到單菌落，該方法簡(jiǎn)單易行，極大地縮減了篩選工作量。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土壤。供試土壤來(lái)源于廣東省河源市筆架山周邊山地腐殖土。

1.1.2培養(yǎng)基。①改良牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：CMC-Na 5.0 g/L，牛肉膏 3.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0。②改良高氏培養(yǎng)基：CMC-Na 5.0 g/L，可溶性淀粉 10.0 g/L，KNO31.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4· 7H2O 0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4· 7H2O 0.01 g/L，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.6。③濾紙條培養(yǎng)基：(NH4)2SO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，MnSO4·H2O 2.5 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 7.5 mg/L，蒸餾水1 000 mL，pH自然。④羧甲基纖維素培養(yǎng)基：CMC-Na 5.0 g/L，(NH4)2SO44.0 g/L，KH2PO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，蛋白胨 1.0 g/L，瓊脂 15.0 g/L，蒸餾水 1 000 mL，pH自然。⑤纖維素剛果紅培養(yǎng)基：CMC-Na 2.0 g/L，(NH4)2SO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO41.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，剛果紅 0.4 g/L，瓊脂 15.0 g/L，蒸餾水 1 000 mL，pH自然。

1.1.3試劑。蛋白胨(Oxoid)，羧甲基纖維素鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4溶液的配制。 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：葡萄糖經(jīng)110 ℃烘干至恒重，準(zhǔn)確稱量，配制0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。1%CMC-Na底物溶液：取0.51 g CMC-Na，加入2 mL pH 4.8，0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，混合定容至100 mL。

1.2方法

1.2.1濾紙條擴(kuò)散分離。稱取0.5 g土樣加入100 mL生理鹽水中，充分振蕩10～20 min。取0.5 mL懸浮液接種于濾紙條培養(yǎng)基中，濾紙條1/3露出培養(yǎng)基液面以上。在30 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察濾紙上菌落生長(zhǎng)和濾紙崩解情況。挑取濾紙條上帶有降解空洞的菌落進(jìn)行剛果紅鑒定平板復(fù)篩，選擇透明圈較大者進(jìn)行菌株保存，并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2濾紙酶(FPA)活力測(cè)定。 取0.5 mL上清酶液，加入1 mL pH 4.8，0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，再加入約50 mg濾紙(1 cm×5 cm)1條，于50 ℃水浴酶解10 min，然后加入3，5-二硝基水楊酸(DNS) 2 mL，沸水浴5 min，流水冷卻后于540 nm下測(cè)定吸光度。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(在試管中加入0.5 mL滅活上清酶液，計(jì)算時(shí)扣除本底)。酶活根據(jù)國(guó)際通用的酶活單位來(lái)表示，即1 mL粗酶液1 min產(chǎn)生1 mg/L還原糖定義為一個(gè)酶活單位(U)。

1.2.3羧甲基纖維素酶(CMC)活力測(cè)定。取0.5 mL上清酶液，加入1% CMC-Na底物溶液2 mL，50 ℃水浴酶解反應(yīng)10 min，然后加入DNS 2 mL，沸水浴5 min，流水冷卻后于540 nm下測(cè)定吸光度，同時(shí)設(shè)置空白組(在試管中加入0.5 mL滅活上清酶液，計(jì)算時(shí)扣除本底)。酶活根據(jù)國(guó)際通用的酶活單位來(lái)表示，即1 mL粗酶液1 min產(chǎn)生1 mg/L還原糖定義為一個(gè)酶活單位(U)。

2結(jié)果與分析

2.1纖維素降解菌株的篩選土壤懸浮液接種于濾紙條培養(yǎng)基中，培養(yǎng)第2天，試管底部出現(xiàn)濾紙屑(圖1A)；5 d后，濾紙條出現(xiàn)斷裂降解現(xiàn)象(圖1B)，并開(kāi)始在上端出現(xiàn)降解菌落(圖1C)，降解菌落周圍濾紙出現(xiàn)圓形降解空洞(圖1D)。挑取這些菌落進(jìn)行剛果紅鑒定平板復(fù)篩，可得到有透明圈的菌落，選擇透明圈最大的菌株X1和X2為后續(xù)研究菌

株(圖2)。

2.2FPA酶和CMC酶活力采用DNS法測(cè)定不同pH下的酶活力，結(jié)果顯示，菌株X1的FPA酶活力最高達(dá)12.3 U，CMC酶活力最高達(dá)8.3 U。菌株X2的FPA酶活力最高達(dá)8.8 U，CMC酶活力最高達(dá)7.8 U(圖3)。

3結(jié)論與討論

該試驗(yàn)依據(jù)自由擴(kuò)散原理，設(shè)計(jì)濾紙條擴(kuò)散試驗(yàn)篩選纖維素降解菌株。由于細(xì)菌個(gè)體可隨培養(yǎng)液擴(kuò)散至未浸沒(méi)的濾紙條，且在擴(kuò)散時(shí)，培養(yǎng)液中的菌體因?yàn)V紙條中纖維素的阻礙作用而被分開(kāi)，經(jīng)培養(yǎng)可在濾紙條上生長(zhǎng)形成能降解纖維素的單菌落，達(dá)到初篩分離的效果。該研究采用該方法一次性獲得2株降解能力較強(qiáng)的纖維素酶產(chǎn)生菌X1和X2，挑取單菌落進(jìn)行剛果紅鑒定平板復(fù)篩培養(yǎng)，可得到有透明圈的菌落，經(jīng)DNS法檢測(cè)酶活，顯示酶活力較強(qiáng)。

雖然纖維素酶的發(fā)現(xiàn)距今已有上百年的歷史，纖維素酶的研究與應(yīng)用取得了很大進(jìn)展，但纖維素酶是一種組成十分復(fù)雜的酶，其作用機(jī)理至今尚未明確。目前菌株所產(chǎn)的纖維素酶大部分都不同程度地存在酶系不完全、酶活不高、酶作用條件苛刻等問(wèn)題。因此，選育優(yōu)良的產(chǎn)纖維素酶菌株，提高降解天然纖維素的能力仍是當(dāng)前和今后纖維素酶研究的

主要方向。

該研究通過(guò)建立操作簡(jiǎn)單的濾紙條擴(kuò)散分離篩選方法，成功地從土壤環(huán)境中篩選出具有較高酶活力的纖維素酶產(chǎn)生菌，這有利于更便捷地選育優(yōu)良產(chǎn)纖維素酶菌株，為纖維素酶的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 李世霞，徐愛(ài)秋，顏懷宇.纖維素酶的研究與應(yīng)用[J].中國(guó)飼料添加劑，2008(8)：37-39.

[2] 陳路劼，劉斌，林白雪，等.降解纖維素嗜熱菌的分離及纖維素酶性質(zhì)分析[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010，39(1)：67-72.

[3] 羅穎，歐陽(yáng)嘉，許婧，等.耐熱纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，26(1)：84-89.

[4] 劉韞滔，禤淑霞，龍傳南，等.纖維素降解菌L-06的篩選、鑒定及其產(chǎn)酶條件的分析[J].生物工程學(xué)報(bào)，2008，24(6)：1112-1116.

[5] 陳偉釗，劉森林，邢苗.耐熱堿性纖維素酶分離純化及酶學(xué)特性研究[J].深圳大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版)，2007，24(2)：212-216.

[6] 李爭(zhēng)明，張娟.纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].生物技術(shù)通報(bào)，2015，31(5)：146-152.

[7] 鄭豪盈，樊永欣.書虱伴生菌中纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及最佳產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2015(8)：4081-4094.

[8] ZHANG Y H P，LYND L R.Toward an aggregated understanding of en-zymatic hydrolysis of cellulase：Noncomplexed cellulase systems[J].Bio-technol Bioeng，2004，88(7)：797-824.

[9] 程仕偉，李坦坦.響應(yīng)面優(yōu)化金橙黃微桿菌YT9 的發(fā)酵條件生產(chǎn)纖維素酶[J].中國(guó)釀造，2013，32(4)：48-51.

[10] MA L，ZHANG J，ZOU G，et al.Improvement of cellulase activity inTri-chodermareesei by heterologous expression of a beta-glucosidase genefromPenicilliumdecumbens[J].Enzyme Microb Tech，2011，49(4)：366-371.

A Screening Method for Cellulose-producing Strains

XU Yan1,2, LIU Yu-ling3, YAN Han-bin1et al

(1. College of Mechanic and Electronic Engineering, Heyuan Polytechnic, Heyuan, Guangdong 517000; 2. College of Science, Shantou University, Shantou, Guangdong 515063; 3. Heyuan Environment Protection Center, Heyuan, Guangdong 517000)

Key wordsDiffusion; Cellulose-producing strains; Screening

Abstract[Objective] To obtain a screening method for cellulose-producing strains, which was simple and effective. [Method] Based on the diffusion principle, filter paper diffusion experiment was used to screen the cellulose-producing strains. [Result] Two cellulose-producing strains (X1, X2) were obtained. DNS test showed that the activities of FPAase and CMCase of two strains were 12.3, 8.3；7.8, 8.8 U, respectively. [Conclusion] Results indicated that filter paper diffusion experiment could be used as a new efficient method to screen cellulose-producing strains.

基金項(xiàng)目廣東省科技項(xiàng)目(2015A040404014)；河源市科技項(xiàng)目(2013-139)；河源市科技項(xiàng)目(源科[2014]12號(hào))。

作者簡(jiǎn)介徐艷(1982- )，女，湖南常德人，講師，在讀博士，從事環(huán)境微生物研究。

收稿日期2016-02-08

中圖分類號(hào)S 188

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)07-122-02