陳亮，辛秀蘭，*，王曉杰，李曄，陳振婭，李燕（.北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，北京0009；.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京0009）

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野生藍莓果渣中花色苷提取工藝研究

陳亮1，辛秀蘭1，*，王曉杰1，李曄1，陳振婭2，李燕1
（1.北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，北京100029；2.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100029）

摘要：以野生藍莓果渣為原料，采用溶劑浸提法提取花色苷，采用pH示差法對花色苷含量進行測定，試驗結(jié)果表明：果渣中花色苷的提取工藝為甲醇的濃度為60 %，鹽酸濃度為0.3 %，提取溫度為30℃，提取時間為2 h，此條件下花色苷的提取率最高，可達231.49 mg/100 g。

關(guān)鍵詞：野生藍莓；果渣；花色苷；提取

藍莓（Blueberry），又稱為藍漿果、越橘，屬杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium.spp）為一種多年生落葉或常綠灌木，矮腳野生[1]。全世界分布的越橘屬植物可達400余種，原產(chǎn)和主產(chǎn)于美國又被稱為美國藍莓。我國主要產(chǎn)在大興安嶺和小興安嶺林區(qū)尤其是大興安嶺中部，而且都是純野生的。大量研究報道，常食藍莓果可以增強視力，抗氧化、延緩衰老，增強心臟功能，并可以預(yù)防炎癥和癌癥[2]。藍莓已被列入世界“第三代新興水果”的行列，也被國際糧農(nóng)組織歸為人類5大健康食品之一，市場前景廣闊。

花色苷（Anthocyanin），是花色素與糖以糖苷鍵結(jié)合而成的一類化合物，廣泛存在于植物的花、果實、莖、葉和根器官的細胞液中，使其呈現(xiàn)由紅、紫紅到藍等不同顏色?；ㄉ帐穷慄S酮—以黃酮核為基礎(chǔ)的一類物質(zhì)中能呈現(xiàn)紅色的一族化合物。由于食品加工業(yè)中常用的人工合成的紅色染料有毒性和致癌的可能性，花色苷的應(yīng)用越來越受到關(guān)注?；ㄉ帐且活愄烊粺o毒的食品添加劑，另外，花色苷還具有很多功效，如抗氧化、清除自由基作用，減少低密度脂蛋白（LDL），抗突變、抗腫瘤，改善視力作用等[3-4]。

藍莓果在種植加工中，由于儲存不當(dāng)或初級加工廢棄會產(chǎn)生大量的壞果、爛果或果渣等廢棄物，但是這些廢棄物中含有大量的具有生物活性的酚類成分，如花色苷、鞣花酸等，尤其是花色苷成分都存在于果皮里，經(jīng)榨汁后常被廢棄，造成大量的浪費，因此，選擇合適的提取工藝，獲得附加值高的天然產(chǎn)物或產(chǎn)品，有利于廢物再利用和環(huán)境保護。本試驗采用廢棄的野生藍莓果渣為原料提取花色苷，研究溶劑浸提法提取花色苷的最佳工藝條件，包括最適溫度、最適溶劑和酸濃度、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)等[5-7]。

1材料與方法

1.1材料

野生藍莓果渣：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)。

1.2試劑

甲醇、濃鹽酸、三氟乙酸、檸檬酸、乙酸、氯化鉀、乙酸鈉，均為分析純，購自北京化工廠。

1.3儀器

Cary50紫外可見分光光度計：美國瓦里安公司；DHZ-D全溫振蕩器：江蘇太倉機械有限公司；WF萬能粉碎機：江陰市康和機械制造有限公司。

1.4方法

1.4.1 pH示差法測定花色苷的含量

花色苷存在的4種形式：藍色的酮式（脫水）堿、紅色的鎓正離子、無色的甲醇假堿和查爾酮式?；ㄉ罩挥性谒嵝越橘|(zhì)中的穩(wěn)定的，因此只測定pH小于7條件下花色苷吸光值的變化。

在單一pH下測定花色苷，會受到其他成分的干擾，在溶質(zhì)介質(zhì)中，花色苷的結(jié)構(gòu)會隨pH的改變而改變，而干擾物質(zhì)的特征光譜不隨pH的改變而改變。

pH為1.0時，花色苷以紅色的2-苯基苯并吡喃的形式存在，pH為4.5時，花色苷以無色的甲醇假堿的形式存在，選擇pH為1.0和4.5為測定條件。在兩個不同的pH下，花色苷溶液的吸光度的差值與花色苷的含量成正比例[8-9]。

氯化鉀緩沖溶液（0.025 mol/L，pH=1.0）配制：1.86 g的氯化鉀溶于980 mL的蒸餾水中，加入少量濃鹽酸調(diào)pH至1.0，再用蒸餾水定容至1 L，混勻即可；

乙酸鈉緩沖溶液（0.4 mol/L，pH=4.5）配制：54.43 g的三水合乙酸鈉溶于960 mL的蒸餾水中，加入少量濃鹽酸調(diào)pH至4.5，再用蒸餾水定容至1 L，混勻即可。

樣品的測定取1 mL的提取液分別用pH=1.0和pH=4.5的緩沖液稀釋定容至兩個10 mL比色管中，放置15 min達平衡后，分別在520 nm和700 nm處測定其吸光度，并根據(jù)下述公式計算各樣品總花色苷的含量，每個樣品平行做3次。

1.4.2藍莓果渣花色苷的提取

藍莓果渣干燥粉碎，稱取1 g藍莓果渣粉，加入適量提取溶劑，在一定條件下進行浸提，真空抽濾，得到提取液，置于容量瓶定容，再用pH示差法進行花色苷含量的測定。

1.4.3花色苷提取單因素試驗設(shè)計

稱取1 g藍莓果渣粉，加入提取溶劑進行浸提，對果渣粉的目數(shù)、提取溶劑、甲醇濃度、添加酸種類、酸濃度、料液比、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)和振蕩轉(zhuǎn)速設(shè)計單因素試驗進行考察，并采用pH示差法進行測定。

1.4.4花色苷提取正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果確定花色苷提取的正交設(shè)計表，選擇出對花色苷提取率影響較大的因素為甲醇濃度（A）、鹽酸濃度（B）、提取溫度（C）、提取時間（D），采用四因素三水平的進行正交試驗，優(yōu)化果渣中花色苷的提取工藝，確定最佳提取工藝參數(shù)。正交試驗因素水平表見表1。

表1正交試驗因素水平表Table 1 The extraction experiments of orthogonal design

2結(jié)果與討論

2.1溶液浸提法單因素試驗結(jié)果

2.1.1藍莓果渣目數(shù)對花色苷提取率的影響

藍莓果渣目數(shù)對花色苷提取率的影響見圖1。

圖1果渣目數(shù)對提取率的影響Fig.1 The influence of mesh number on anthocyanin extraction

分別取20、40、60、80、100目的果渣，加入提取溶劑提取，其他提取參數(shù)相同，由圖1可知，果渣目數(shù)小，果渣顆粒較大，花色苷不易從果渣中溶出，當(dāng)果渣目數(shù)較大時，果渣顆粒微小，不易過濾，濾紙上花色苷殘留吸附嚴(yán)重，故當(dāng)果渣目數(shù)為60目時，果渣顆粒合適，易于過濾且適于花色苷溶出，花色苷的提取率最高。

2.1.2提取溶劑對花色苷提取率的影響

提取溶劑對花色苷提取率的影響見圖2。

圖2提取溶劑對花色苷提取率的影響Fig.2 The influence of extraction solvent on anthocyanin extraction

采用60目的果渣4份，分別加入水、甲醇、乙醇和丙酮等不同提取溶劑進行提取，其他提取參數(shù)相同，由圖2可知，花色苷在水中溶出提取不完全，顏色較淺，甲醇、乙醇和丙酮的提取率較高，其中，甲醇的提取率最高。

2.1.3甲醇濃度對花色苷提取率的影響

甲醇濃度對花色苷提取率的影響見圖3。

圖3甲醇濃度對花色苷提取率的影響Fig.3 The influence of methanol concentration on anthocyanin extraction

配制不同甲醇濃度的提取液，分別進行花色苷的提取，其他提取參數(shù)相同，由圖3可知，水中花色苷提取率較低，隨著甲醇濃度逐漸提高，花色苷的含量逐漸增加，當(dāng)甲醇濃度達到60 %時，花色苷的提取率基本變化不明顯，故提取溶劑選擇60 %的甲醇水溶液。

2.1.4不同酸對花色苷提取率的影響

不同酸對花色苷提取率的影響見圖4。

圖4不同酸對花色苷提取率的影響Fig.4 The influence of acid on anthocyanin extraction

向4份60 %的甲醇溶液提取劑中分別加入三氟乙酸、檸檬酸、乙酸、鹽酸，進行花色苷的提取，其他提取參數(shù)相同，由圖4可知，使用三氟乙酸時，花色苷的提取率最高。但考慮到試驗成本和操作的復(fù)雜程度，且鹽酸的提取率和三氟乙酸相差不大，故采用鹽酸為最佳添加酸。

2.1.5鹽酸濃度對花色苷提取率的影響

鹽酸濃度對花色苷提取率的影響見圖5。

分別配制不同鹽酸濃度的60 %的甲醇提取溶劑，其他提取參數(shù)相同，由圖5可知當(dāng)采用0.2 %的60 %的酸化甲醇水溶液時，花色苷的提取率最高，故提取溶劑中添加酸的含量為0.2 %（體積分數(shù)）。

圖5鹽酸濃度對花色苷提取率的影響Fig.5 The influence of hydrochloric acid concentration on anthocyanin extraction

2.1.6料液比對花色苷提取率的影響

料液比對花色苷提取率的影響見圖6。

圖6料液比對花色苷提取率的影響Fig.6 The influence of ratio of solid to liquid on anthocyanin extraction

分別采用不同的料液比分別對果渣中的花色苷進行提取，其他提取參數(shù)相同，由圖6可知，當(dāng)料液比為1∶30（g/mL）時，花色苷的提取率最高，1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）的料液比對花色苷的提取率影響不大，為了節(jié)約溶劑成本，確定1∶20（g/mL）為最佳料液比。

2.1.7提取溫度對花色苷提取率的影響

提取溫度對花色苷提取率的影響見圖7。

圖7提取溫度對花色苷提取率的影響Fig.7 The influence of extration temperature on anthocyanin extraction

將果渣和提取溶劑按1∶40（g/mL）的料液比混合，設(shè)定不同溫度進行提取，其他提取參數(shù)相同，由圖7可知，20℃時提取率最低，而當(dāng)溫度設(shè)定到40℃時，溶劑部分揮發(fā)，且花色苷對熱敏感，有少量降解，當(dāng)提取溫度為30℃時花色苷的提取率最高，故提取溫度控制在30℃。

2.1.8提取時間對花色苷提取率的影響

提取時間對花色苷提取率的影響見圖8。

圖8提取時間對花色苷提取率的影響Fig.8 The influence of extration time on anthocyanin extraction

稱取6份相同質(zhì)量的果渣，按料液比為1∶20（g/mL）加入提取溶劑，設(shè)定溫度設(shè)為30℃，分別進行不同時間的提取，其他提取參數(shù)相同，圖8表明，當(dāng)提取時間為2 h時，花色苷的提取率達到最高，隨著時間增加，花色苷有少量減少，但變化不明顯，故提取時間選擇2 h。

2.1.9提取次數(shù)對花色苷提取率的影響

提取次數(shù)對花色苷提取率的影響見圖9。

圖9提取次數(shù)對花色苷提取率的影響Fig.9 The influence of extration times on anthocyanin extraction

稱取3份相同質(zhì)量的果渣，分別進行1次、2次、3次的提取，其他提取參數(shù)相同，由圖9可知，提取次數(shù)越多，提取率越小，且第1次和第2次差別很大，第2次遠小于第1次，花色苷在第1次提取時得到的最多。為了節(jié)約時間和成本，試驗采用提取1次的方法。

2.1.10振蕩轉(zhuǎn)速對花色苷提取率的影響

振蕩轉(zhuǎn)速對花色苷提取率的影響見圖10。

圖10轉(zhuǎn)速對花色苷提取率的影響Fig.10 The influence of oscillation speed on anthocyanin extraction

設(shè)定不同的振蕩轉(zhuǎn)速，進行花色苷的提取，其他提取參數(shù)相同，由圖10可知當(dāng)提取溫度為30℃，提取時間為2 h時，提取次數(shù)為1次，酸濃度為0.2 %，甲醇濃度為60 %的提取溶劑，料液比為1∶20（g/mL）時，轉(zhuǎn)速對花色苷的提取效率影響不大。

2.2正交試驗優(yōu)化溶液浸提法提取工藝結(jié)果

根據(jù)單因素試驗各因素對提取效果的影響以及取值的范圍，設(shè)計正交試驗確定最佳提取條件，正交試驗結(jié)果及分析見表2。

表2正交設(shè)計試驗結(jié)果Table 2 The extraction results of orthogonal design

由表2結(jié)果可知，各因素影響花色苷提取率的主次關(guān)系為A>B>D>C，最佳的提取條件為A3B3C2D1或A3B3C3D1，即當(dāng)甲醇的濃度為60 %，鹽酸的濃度為0.4 %，提取溫度為30℃，提取時間為2 h，花色苷的提取率最高，達到219.40 mg/100 g。

對由k值分析得出的最佳方案進行驗證試驗，試驗結(jié)果表明在甲醇的濃度為60 %，鹽酸的濃度為0.3 %，提取溫度為30℃，提取時間為2 h，花色苷的提取率最高，為231.49 mg/100 g，因此最佳提取條件為A3B2C2D1。

藍莓花色苷具有抗氧化、清除自由基、抗癌和改善視力等生物活性，具有巨大的保健功能。李穎暢等研究發(fā)現(xiàn)，藍莓花色苷使高脂血癥大鼠血脂水平和動脈粥樣硬化指數(shù)（AI）顯著降低，血清和肝臟T-AOC、SOD和GSH-Px活性明顯增強，MDA的生成量顯著減少[10-11]。

3　結(jié)論

以藍莓果渣為原料提取花色苷的最佳提取工藝條件為，甲醇濃度60 %，鹽酸濃度0.3 %，提取溫度30℃，提取時間為2 h，提取次數(shù)為1次，花色苷的提取效率最高，為藍莓果渣的廢物利用、變廢為寶，規(guī)?；崛∩a(chǎn)提供工藝參數(shù)。

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Study on Extraction of Anthocyanin from Wild Blueberry Pomace

CHEN Liang1，XIN Xiu-lan1，*，WANG Xiao-jie1，LI Ye1，CHEN Zhen-ya2，LI Yan1
（1. College of Bioengineering，Beijing Polytechnic，Beijing 100029，China；2. College of Life Science and Technology，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China）

Abstract：Wild blueberry pomace was used as the raw material to extract anthocyanin by solvent extraction，and the anthocyanin content was determined by pH-differential method. The results demonstrated that the optimum process conditions for anthocyanin extraction was methanol concentration of 60 %，concentration of hydrochloric acid of 0.3 %，extraction temperature of 30℃and extraction time of 2 h. The total anthocyanin content was 231.49 mg/100 g.

Key words：wild blueberry；pomace；anthocyanin；extract

收稿日期：2014-12-01

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.014

*通信作者：辛秀蘭（1968—），女（漢），教授，博士，研究方向：小漿果資源的研究與推廣。

作者簡介：陳亮（1986—），男（漢），講師，博士，研究方向：小漿果產(chǎn)品的研究與開發(fā)。

基金項目：北京市教委科技計劃面上項目（KM201510858001）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201103037）；促進人才培養(yǎng)綜合改革項目“色譜技術(shù)在天然活性物質(zhì)篩選中的應(yīng)用”；北京電子科技職業(yè)學(xué)院教育教學(xué)改革項目；促進人才培養(yǎng)（師資隊伍建設(shè)）-校內(nèi)專業(yè)教學(xué)團隊和優(yōu)秀人才培養(yǎng)計劃項目（CJRC-SZDW-2015/001）