高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)豆芽中的6-芐基腺嘌呤含量

6-芐基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）是一種人工合成的細(xì)胞分裂素，與植物內(nèi)源性激素具有相似的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，為一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[1]。如果人體攝入過量會(huì)刺激皮膚黏膜，出現(xiàn)食道和胃黏膜損傷、惡心、嘔吐等癥狀。目前，測(cè)定豆芽中6-BA的方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-大氣壓化學(xué)源質(zhì)譜法及液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法[2-4]等。本研究采用LC-MS/MS法來測(cè)定豆芽中的6-BA，提取試劑為酸化甲醇，以乙腈及水（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)過反相色譜分離后以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式進(jìn)行檢測(cè)。

材料和方法

儀器 API 4000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，LC-20A液相色譜儀（包括二元輸液泵及自動(dòng)進(jìn)樣器)。藥品及試劑 6-BA標(biāo)準(zhǔn)品（含量97.0%）,甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液 精密稱取6-BA 0.1000g于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。此標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液每毫升相當(dāng)于1.0mg 6-BA。

色譜柱：Symmetry C18柱，3.5m，150×2.1mm I.D.，waters公司；流動(dòng)相：乙腈-水（含0.1%甲酸）；流速：0.25 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL。梯度洗脫條件見表1。

時(shí)間（min） 水相 有機(jī)相9.5 90% 10% 12 90% 10%

質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子化源；離子噴射電壓：5500V；溫度：500℃；源內(nèi)氣體1（GS1，N2）壓力：55psi；氣體2（GS2，N2）壓力：55psi；氣簾氣體（N2）壓力：15psi；正離子方式檢測(cè)；6-BA的解簇電壓（DP）為70V，碰撞能量（CE）為80eV；用于定量分析的離子反 應(yīng) 為m/z 226.2→m/z 64.9，6-BA結(jié) 構(gòu) 及[M+H]+的產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 6-BA的結(jié)構(gòu)及[M+H]+的產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖

豆芽樣品的預(yù)處理 稱取豆芽樣品500g用食物粉碎機(jī)粉碎后，取5g樣品（精確至0.01g）于50mL聚丙烯離心管中，加入10mL酸化甲醇（每100mL甲醇中加入乙酸100μL，混勻），用均質(zhì)機(jī)勻質(zhì)3min，超聲提取3min，1,2000rpm離心10min，上清液轉(zhuǎn)入25mL容量瓶中，樣品再用10mL酸化甲醇重復(fù)提取一次。合并上清液，用水定容至刻度，搖勻，取部分液體經(jīng)0.45μm濾膜過濾，供LC-MS/MS分析。

空白豆芽萃取液制備 選擇在生產(chǎn)過程中未添加6-BA的豆芽。按1.6試樣處理方法提取，經(jīng)0.45μm有機(jī)濾膜過濾?？蛇M(jìn)行LC-MS/MS分析，以確定在6-BA出峰處不存在干擾。

結(jié)果與討論

色譜行為和專屬性 按“豆芽樣品的預(yù)處理”操作,分別制備空白豆芽樣品、空白豆芽加入6-BA標(biāo)準(zhǔn)溶液（相當(dāng)于含15μg/kg6-BA的豆芽樣品）進(jìn)行測(cè)試。典型色譜圖分別見圖2-A和圖2-B。結(jié)果表明：空白豆芽中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾6-BA的測(cè)定。

圖2 測(cè)定豆芽中6-BA的典型MRM色譜圖

線性范圍和靈敏度 取空白豆芽萃取液，依次加入適量6-BA標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，配制成相當(dāng)于豆芽濃度為2.5、5、15、45和100μg/kg的豆芽樣品萃取液，按“豆芽樣品的預(yù)處理”項(xiàng)下操作，記錄色譜圖；以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=1.35e+004x+2.58e+003，r =0.9983）。結(jié)果表明6-BA在2.5～100μg/kg范圍內(nèi)線性良好，方法檢出限為1μg/kg（信噪比S/N=3）。

回收率和精密度 試驗(yàn)分別制備了相當(dāng)于含6-BA 5、15和100μg/kg的低、中、高3個(gè)濃度豆芽樣品，按1.6項(xiàng)的操作方法進(jìn)行處理，每濃度六樣本分析，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)進(jìn)行，以當(dāng)時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的測(cè)得濃度，求得本法的精密度與回收率。低、中、高3個(gè)濃度的回收率范圍分別為90%～98%、92%～101%和91%～102%，精密度分別為4.5%、5.6%和8.9%，結(jié)果均符合相關(guān)要求。

質(zhì)譜條件優(yōu)化 將濃度為100ng/mL的6-BA標(biāo)準(zhǔn)溶液吸入注射器中，放置于蠕動(dòng)泵進(jìn)樣器上，以20 L/min的速度進(jìn)樣，對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，盡量使待測(cè)物響應(yīng)信號(hào)最高化。在實(shí)驗(yàn)過程中比較了6-BA在正、負(fù)兩種離子化方式的響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)正離子化效率高于負(fù)離子化效率，正離子響應(yīng)較為穩(wěn)定，因此選擇了正離子掃描方式。

經(jīng)過Q1全掃描，選擇了響應(yīng)信號(hào)最高的m/z 226.2作為6-BA分析的母離子，在MS2掃描方式下，找到一些碎片離子，其中m/z 91.0響應(yīng)最高，m/z 64.9次之，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描方式下，m/z 226.2→m/z 91.0離子對(duì)響應(yīng)信號(hào)較高，但干擾較大，故選擇m/z 226.2→m/ z 64.9用于6-BA的定量分析。在MRM模式下，在蠕動(dòng)泵持續(xù)進(jìn)樣的情況下，對(duì)各項(xiàng)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使得待測(cè)物響應(yīng)值達(dá)到最高。

色譜條件優(yōu)化 雖然質(zhì)譜專屬性高，但將樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)與待測(cè)物進(jìn)行分離還是必要的，以減少對(duì)測(cè)定的干擾，所以對(duì)色譜條件進(jìn)行了選擇及優(yōu)化。

6-BA在小粒徑的C18色譜柱上都有較好的保留，所以選擇了實(shí)驗(yàn)室常用的Symmetry C18柱（3.5μm，150×2.1mm I.D.)。應(yīng)用反相色譜條件時(shí)，LC-MS/MS分析方法應(yīng)用的有機(jī)相主要為乙腈和甲醇，選用乙腈時(shí)，6-BA的色譜行為較好。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)甲酸的加入會(huì)抑制6-BA的信號(hào)，但考慮到能夠使待測(cè)物與內(nèi)源性物質(zhì)充分分離，并且能夠改善峰形，所以選擇了0.1%的甲酸作為水相。

提取條件的選擇 試驗(yàn)中考察了以下幾種提取試劑，包括甲醇、酸化甲醇和乙酸乙酯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酸化甲醇的提取效率要高于另外兩種試劑，而超聲提取的使用同樣會(huì)提高待測(cè)物的提取效率，所以最終選擇了用酸化甲醇作為提取試劑，進(jìn)行超聲提取。

本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法來檢測(cè)豆芽中的6-芐基腺嘌呤含量，方法采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)進(jìn)行定量，排除了內(nèi)源性物質(zhì)干擾，提高了專屬性。該法靈敏度高、準(zhǔn)確可靠，檢出限達(dá)到1μg/kg，前處理方法簡(jiǎn)單，有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

□ 沈陽食品檢驗(yàn)所

穆姣姣 崔相勇 周長(zhǎng)民 王冬妍