孫潔 楊素芬 白圖門 李梅 董迅 陳小萍

【摘要】目的：分析并探討卵巢癌患者腹水及外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞含量及抑制功能。方法：選取2012年2月至2015年2月期間在我院和寧波市鄞州第二醫(yī)院接受治療的卵巢癌患者56例，采集腹水標(biāo)本56例，外周血標(biāo)本56例。使用流式細胞術(shù)檢測CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）的表達。采用15μmol/L的羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）標(biāo)記CD4+CD25- T細胞，觀察CFSE標(biāo)記效果，計算抑制率。結(jié)果：研究結(jié)果顯示，56例腹水患者CD4+CD25+ T cells/CD4+T cell為（2834±1327）%，56例外周血標(biāo)本CD4+CD25+ T cells/CD4+ T cell為（1456±436）%。腹水和外周血標(biāo)本CD4+CD25+ T cells/CD4+ T cell含量有顯著差異（P<005）。腹水Treg抑制功能比外周血Treg強，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005）。結(jié)論：腹水Treg含量及抑制功能比外周血Treg強，提示卵巢癌腹腔內(nèi)相對容易發(fā)生免疫逃逸，而Treg升高可能參與促進腫瘤復(fù)發(fā)。

【關(guān)鍵詞】卵巢癌；腹水；外周血；CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞

【中圖分類號】R73731【文獻標(biāo)志碼】A

卵巢癌是一種女性常見婦科惡性腫瘤，是女性致死率最高的腫瘤類型，已嚴(yán)重威脅其患者的生命健康[1]。臨床中未見腫瘤初期的敏感診斷方式，這將導(dǎo)致一經(jīng)確診基本為中晚期，延誤最佳治療時機[2]。近年來，針對卵巢癌的免疫學(xué)機制研究逐漸成為熱點，對腫瘤微環(huán)境的免疫學(xué)機制變化深入了解，有助于提高未來卵巢癌早期診斷及后期治療的成功率[3]。在本次研究中，選取卵巢癌患者56例，分析并探討卵巢癌患者腹水及外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞含量及抑制功能。

1資料與方法

11一般資料

選取2012年2月至2015年5月期間在我院和寧波市鄞州第二醫(yī)院接受治療的卵巢癌患者56例，采集腹水標(biāo)本56例，外周血標(biāo)本56例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理檢查和細胞學(xué)檢查均被確診為卵巢癌；（2）簽署知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）感染性疾病患者；（2）非自愿參加者。該研究得到倫理學(xué)會的批準(zhǔn)，且在采集標(biāo)本前得到了患者的許可，允許進行后續(xù)實驗。

12實驗方法

在卵巢癌患者腹腔穿刺術(shù)后采集腹水標(biāo)本，并使用無菌的引流袋將其安置于冰中保存用于后續(xù)實驗分析。外周血標(biāo)本則在清晨空腹后采集靜脈血獲得，加入EDTA抗凝處理[4]。

使用流式細胞術(shù)檢測CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）的表達[5]。使用CD4+Multisort kit獲得CD4+ T細胞，然后使用CD25的磁珠陽性分選得到CD4+CD25+ T細胞和CD4+CD25- T細胞。經(jīng)檢測，CD4+CD25+ T細胞濃度在90%以上。

分選得到CD4+CD25+ T細胞和CD4+CD25- T細胞，采用15μmol/L的羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）標(biāo)記CD4+CD25- T細胞，觀察CFSE標(biāo)記效果[6]。CD4+CD25+ T細胞和CFSE標(biāo)記的CD4+CD25- T細胞按0：1、1：1、1：2及1：4比例在10%的胎牛血清-RPMI-1640培養(yǎng)體系內(nèi)進行共培養(yǎng)，加入人淋巴細胞CD3單克隆抗體、人淋巴細胞CD28單克隆抗體以及人重組IL-2作為激活因子。5d后使用流式細胞儀檢測CFSE表達，計算抑制率。

13統(tǒng)計學(xué)分析

對觀測結(jié)果使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 190分析，計量資料采取t檢驗，率的比較采取卡方檢驗，以P<005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2結(jié)果

21卵巢癌腹水及外周血中CD4+CD25+ T細胞的檢測結(jié)果分析研究結(jié)果顯示，56例腹水患者CD4+CD25+ T cells/CD4+ T cell為（2834±1327）%，56例外周血標(biāo)本CD4+CD25+ T cells/CD4+ T cell為（1456±436）%。腹水和外周血標(biāo)本CD4+CD25+ T cells/CD4+ T cell含量有顯著差異，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005）。

22卵巢癌腹水及外周血CD4+CD25+免疫抑制功能測定結(jié)果分析腹水Treg抑制功能比外周血Treg強，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005）。見表1。表1卵巢癌腹水及外周血CD4+CD25+免疫抑制功能測定樣本例數(shù)

（例）S/R（%）1：11：21：4腹水567437±14337053±13334454±1253血液565849±5635101±4562841±444t547711614P<005<005<005

3討論

隨著近年來腫瘤研究逐漸深入，許多文獻證實部分腫瘤抗原與自身抗原相似甚至相同，免疫細胞對外來抗原發(fā)揮識別、清除功能，但因部分腫瘤抗原與自身抗原相同，未成功識別，從而使腫瘤繼續(xù)生長蔓延[7]。研究表明，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞具有抑制自身T細胞表達及識別的能力，可以進一步幫助腫瘤細胞在免疫系統(tǒng)監(jiān)控下逃脫[8]。基于上述理論，近年來針對CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系研究逐漸增多，對腫瘤微環(huán)境的免疫學(xué)機制變化深入了解，有助于提高未來卵巢癌早期診斷及后期治療的成功率。

有研究證實，在肝癌、乳腺癌及結(jié)腸癌患者血清中發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量有所增多，且在腫瘤病灶處結(jié)果亦然[9]。隨后，有人報道發(fā)現(xiàn)在卵巢癌患者中發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞也有所增加，并且隨著癌癥的發(fā)展，增加的愈發(fā)明顯。增加的越明顯，該疾病的預(yù)后表現(xiàn)越差[10]。腫瘤病灶甚至全血內(nèi)存在一定免疫抑制，這種抑制可能是通過CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞介導(dǎo)的，同時有報道證實，這種介導(dǎo)并非由活化T細胞刺激而來[11]。動物實驗表明，通過體外注射抑制CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞活性藥物，可有效減輕小鼠體內(nèi)免疫抑制情況[12]。針對上述現(xiàn)象，目前主要有兩種可能假設(shè)：腫瘤發(fā)生后，刺激CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞增殖，繼而引起免疫抑制；腫瘤表面抗原使CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞發(fā)生常規(guī)增殖[13]。

為了進一步分析并探討卵巢癌患者腹水及外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞含量及抑制功能，進行本次調(diào)查研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，56例腹水患者CD4+CD25+ T cells/CD4+ T cell為（2834±1327）%，56例外周血標(biāo)本CD4+CD25+ T cells/CD4+ T cell為（1456±436）%。腹水和外周血標(biāo)本CD4+CD25+ T cells/CD4+ T cell指數(shù)有顯著差異，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005）。有報道指出，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞并不能用來研究其抑制功能，但因腹腔轉(zhuǎn)移是卵巢癌患者主要轉(zhuǎn)移途徑，且部分研究報道中確實提出腹水內(nèi)該調(diào)節(jié)性T細胞能在一定程度上預(yù)測疾病進展[14]。同時，本次研究中顯示腹水Treg抑制功能比外周血Treg強，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005）。這可能說明CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞對腫瘤趨化、募集有一定作用，通過作用于趨化因子等誘導(dǎo)細胞遷移[15]。

綜上所述，腹水Treg含量及抑制功能比外周血Treg強，提示卵巢癌腹腔內(nèi)相對容易發(fā)生免疫逃逸，而Treg升高可能參與促進腫瘤復(fù)發(fā)。

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