王笑男，張志強，張立新

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種嚴重威脅人類健康及生存質(zhì)量的疾病，并且主要發(fā)病人群為青壯年,目前尚無有效治療方法。SCI后形成的膠質(zhì)瘢痕對中樞神經(jīng)有一定的保護作用，使其免受進一步損害，但是膠質(zhì)瘢痕形成阻礙了神經(jīng)再生，影響功能恢復。因此，在治療SCI過程中，抑制膠質(zhì)瘢痕形成是非常重要的。Zhang等[1]通過骨髓間充質(zhì)干細胞移植聯(lián)合硫酸軟骨素酶ABC(Chondritinase ABC, ChABC)注射治療，證實二者聯(lián)合作用對大鼠SCI后神經(jīng)修復有效。臨床上，小劑量超短波治療具有改善血液循環(huán)、組織營養(yǎng)及消炎等作用,應用廣泛。 膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillaty acidic protein, GFAP)是活化星形膠質(zhì)細胞標記物。活化的星形膠質(zhì)細胞分泌大量的神經(jīng)抑制因子——硫酸軟骨素蛋白聚糖(chondroitin sulphate proteoglycans, CSPGs)，CSPGs是參與膠質(zhì)瘢痕形成的重要分子[2]。因此本實驗通過術后觀察大鼠運動功能及檢測GFAP、CSPGs表達水平，來觀察ChABC聯(lián)合超短波治療能否進一步抑制膠質(zhì)瘢痕形成，從而進一步促進大鼠運動功能恢復。

1 材料與方法

1.1 實驗器材與試劑 ①器材：腦損傷打擊器，PE10微導管，微量注射器。②試劑： 硫酸軟骨素酶ABC(Sigma公司，10U)。GFAP第一抗體，內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復液I，GFAP第二抗體，SABC，DAB顯色劑A、DAB顯色劑B、DAB顯色劑C。CSPGs第一抗體、抗原修復液。內(nèi)源性過氧化物酶，CSPGs第二抗體，動物非免疫血清，鏈霉素抗生物素-過氧化氫酶(SP)溶液，DAB緩沖液，DAB底物，DAB色原。

1.2 方法 ①動物分組：8周齡SD大鼠，雌雄不限，共42只。隨機分成3組，每組14只。分別為對照組(其中8只為單純損傷組，另外6只為加PBS溶液治療的安慰劑組)、ChABC組、聯(lián)合組(ChABC聯(lián)合超短波治療)。②造模：按改良Allen's法制作大鼠脊髓損傷模型：大鼠在5%水合氯醛腹腔麻醉(0.6ml/100g)下俯臥固定，依據(jù)T2椎體，找到T10，以T10為中心作皮膚切口長約3cm，剝離周圍軟組織后顯露并咬除T10及部分T9、T11棘突和椎板，骨窗大小約4×8mm，暴露脊髓背側硬脊膜，將動物固定在致傷裝置底座上，使沖擊棒套管下端之弧形面與脊髓背面貼附良好，之后用10g沖擊棒自10cm高處自由下落打擊脊髓，形成脊髓損傷模型，沖擊棒直徑2mm，致傷能量為100gcf。然后，對照組中的單純損傷組逐層關閉切口。術中操作注意嚴格無菌。術后腹腔注射青霉素3d，4萬單位/日/只，觀察有無血尿，必要時繼續(xù)注射青霉素。根據(jù)傷情膀胱擠壓協(xié)助排尿，2次/日，直至恢復自行排尿。此外，ChABC組和聯(lián)合組及加PBS治療的對照組打擊脊髓后，再咬除T12右側半椎板作為蛛網(wǎng)膜下腔置管區(qū)，將PE10導管置入蛛網(wǎng)膜下腔，孔尖距損傷區(qū)1～2mm。將導管固定于肌肉上。逐層關閉切口，同時進一步固定PE10導管。④干預：對照組中的加PBS安慰劑組、ChABC組和聯(lián)合組術后立即用微量注射器經(jīng)PE10導管注射1U/mL ChABC或PBS溶液6μl，以后每天同量給藥1次，1周后停藥。此外，聯(lián)合組術后第2天予小劑量超短波治療(上海產(chǎn)五官超短波治療儀用2個2號極板放置于大鼠的兩側，位置在損傷的脊髓區(qū)，極板距離大鼠2cm)，用無熱量治療，治療前用氖泡燈調(diào)諧，每天1次，每次7min，至取材前一天。

1.3 評定標準 評估各組大鼠術后1天及1～4周每周的運動能力，測量術后2周、4周大鼠脊髓標本損傷區(qū)的GFAP、CSPGs平均光密度值。①運動功能評分：采用BBB(Basso,Beattie & Bresnahan locomotor rating scale, BBB)運動評分法，BBB評分包括：評判動物后肢各關節(jié)活動(0～7分)；評判動物后肢的步態(tài)和協(xié)調(diào)功能(8～13分)；評判動物運動過程中爪的精細動作(14～21分)，滿分21分。②免疫組織化學染色：各組大鼠脊髓取材做免疫組織化學染色。用裝有圖像采集軟件NIS-Elements F 3.0的設備采集圖像。先在低倍鏡下確定脊髓損傷位置，再用400倍放大鏡下采集脊髓損傷部位圖像。圖像采集方法是均勻沿瘢痕周邊拍5張圖片，以保證覆蓋損傷區(qū)。用NIS-Elements Br 3.0對所有采集的圖像進行半定量分析，直接測出GFAP、CSPGs的平均光密度值。因每個標本采集了5張圖像，因此測出了5個平均光密度值。最后對每個標本的5個平均光密度值取算術平均值，并將其輸入表格進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 BBB運動功能評分 對照組：術后1周的評分雖然比1d高，但差異無統(tǒng)計學意義；術后2周到3周連續(xù)提高(P<0.05，0.01)；術后4周的評分雖然比3周高，但差異無統(tǒng)計學意義。ChABC組：術后1周的評分雖然高于1d但差異無統(tǒng)計學意義，術后2周開始均開始連續(xù)調(diào)高(P<0.05)。聯(lián)合組：術后1周到2周評分連續(xù)提高(P<0.01，0.05)；雖然3周與2周相比，4周與3周相比均有升高趨勢，差異均無統(tǒng)計學意義；而4周評分明顯高于2周(P<0.01)。組間比較：聯(lián)合組在術后1～4周各時間點的BBB評分均高于對照組(P<0.05，0.01)。ChABC組僅在術后第4周高于對照組(P<0.01)；其余各時間點與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。ChABC治療組與聯(lián)合治療組在各時間點比較差異均無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 3組術后各時間點BBB評分比較 分，

與組內(nèi)前一時間點比較，aP<0.05，bP<0.01；與術后2周比較，cP<0.01；與同時間點對照組比較，dP<0.01

2.2 GFAP免疫組化 術后2周至4周，3組各自的GFAP平均光密度值均無明顯變化。術后2周，ChABC組和聯(lián)合組的GFAP平均光密度值均明顯低于對照組(P<0.01)；術后4周，對照組的GFAP平均光密度值與兩個治療組相比，差異均無統(tǒng)計學意義。見圖1，表2。

2.3 CSPGs免疫組化 對照組術后4周時，CSPGs陽性表達明顯低于術后2周(P<0.01)，ChABC治療組和聯(lián)合組各自的GFAP平均光密度值均無明顯變化。術后2周，ChABC組和聯(lián)合組與對照組比較CSPGs平均光密度值明顯降低(P<0.01)，術后4周，組間差異消失。兩個治療組相比，兩個時間點的組間差異均無統(tǒng)計學意義。見圖2，表2。

圖1 術后2周及4周時3組CSPGs免疫組化比較(×400)

圖2 術后2周及4周3組GFAP免疫組化比較(×400)

組別nGFAP2周4周CSPGs2周4周對照組70.27±0.050.28±0.080.44±0.020.34±0.02aChABC組70.22±0.01b0.22±0.010.33±0.01b0.34±0.02聯(lián)合治療組70.22±0.01b0.22±0.010.34±0.02b0.34±0.02

與組內(nèi)術后2周時比較，aP<0.01；與對照組比較，bP<0.01

3 討論

SCI后會產(chǎn)生復雜的免疫反應，包括細胞免疫、體液免疫。在此過程中，星形膠質(zhì)細胞被激活，活化的星形膠質(zhì)細胞過度增生導致膠質(zhì)瘢痕形成。膠質(zhì)瘢痕中的星形膠質(zhì)細胞表現(xiàn)為胞體增大，突起增多變粗，膠質(zhì)瘢痕將空洞與周圍脊髓組織隔離[3]。雖然SCI后形成的膠質(zhì)瘢痕可以起到保護作用，阻止了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的進一步損害，但是膠質(zhì)瘢痕形成阻礙了神經(jīng)再生，影響了SCI后神經(jīng)功能恢復。所以，SCI后對膠質(zhì)瘢痕形成的抑制是一個有價值的治療。GFAP是神經(jīng)膠質(zhì)細胞的主要細胞骨架成分，在成熟的神經(jīng)系統(tǒng)中，主要存在于星形膠質(zhì)細胞中。GFAP是星形膠質(zhì)細胞的標記物,它的變化反應了星形膠質(zhì)細胞的狀態(tài)。在SCI后，GFAP早期促進神經(jīng)再生，后期形成膠質(zhì)瘢痕[4]。SCI后，活化的星形膠質(zhì)細胞可分泌表達CSPGs，而CSPGs主要是由星形膠質(zhì)細胞分泌的,其是參與膠質(zhì)瘢痕形成的重要分子[2]。Plant等[5]通過實驗認為CSPGs很可能是阻礙軸索再生的分子抑制屏障。Morgenstern等[6]認為在中樞神經(jīng)損傷處CSPGs是一重要的抑制因子，使中樞神經(jīng)成功再生就要抑制產(chǎn)生CSPGs的細胞或分子。因此，本實驗選擇GFAP、CSPGs來觀察ChABC治療和超短波聯(lián)合ChABC治療對膠質(zhì)瘢痕形成的抑制效果。張海燕等[7]的研究表明，CSPGs在損傷后開始上調(diào)，傷后7天開始達到高峰，至2周開始下調(diào)，1個月后開始趨于穩(wěn)定；黃凱等[8]通過大鼠實驗表明，脊髓損傷后4周膠質(zhì)瘢痕厚度達到高峰，囊腔與殘存軸突之間開始形成機械屏障，與我們對照組的實驗結果相一致。因此，本實驗在大鼠SCI術后立即給藥，并選擇術后2周、4周作為CSPGs、GFAP因子的觀察時間點。

硫酸軟骨素是一種酸性粘多糖類生物大分子，常見的有3種類型ChS-A、ChS-B、ChS-C。ChABC是一種裂解酶，具有降解ChS-A、ChS-B、ChS-C及透明質(zhì)酸等功能，能特異性破壞大部分的CSPGs的葡糖胺聚糖鏈(GAG)，酶的半衰期較短。Xu等[9]通過蛛網(wǎng)膜下腔注射ChABC，發(fā)現(xiàn)ChABC能抑制膠質(zhì)瘢痕，改善損傷區(qū)微環(huán)境，提高GAP-43的表達，促進軸索生長和延伸。因此，本實驗采用蛛網(wǎng)膜下腔給藥，連續(xù)給藥1周。實驗結果顯示，ChABC組和聯(lián)合組在術后2周的CSPGs平均光密度值均明顯低于對照組，術后4周的CSPGs平均光密度值無明顯差異，說明在損傷后用ChABC治療或超短波聯(lián)合ChABC治療確實能夠較大幅度抑制CSPGs的上調(diào)，使CSPGs維持在較低的水平，從而有效抑制了阻礙軸索再生的化學屏障，但隨著病程的延長，CSPGs的表達也可自然恢復到較低水平。因為GFAP是星形膠質(zhì)細胞的標記物，活化的星形膠質(zhì)細胞參與構成膠質(zhì)瘢痕的機械屏障。Zhang等[10]通過實驗認為ChABC能夠抑制GFAP的表達，減弱膠質(zhì)瘢痕形成，促進軸索再生。本實驗結果顯示：在術后2周，聯(lián)合組與ChABC組的GFAP的平均光密度值均明顯低于對照組，而術后4周，雖然對GFAP有作用，但是因平均光密度值結果差異較大，而且樣本量不足，雖有趨勢，但無統(tǒng)計學差異，實驗結果說明用ChABC治療也能夠在SCI后有效抑制GFAP增高，進而抑制了SCI后膠質(zhì)瘢痕形成的機械屏障。綜上所述，ChABC治療組和聯(lián)合治療組對SCI后膠質(zhì)瘢痕形成產(chǎn)生了明顯的抑制作用。

Starkey等[11]通過實驗，認為用ChABC治療能夠促進功能恢復，本實驗結果顯示在術后4周ChABC治療組和聯(lián)合治療組的大鼠后肢功能恢復均明顯比對照組要好，證實了用ChABC治療確實能夠促進大鼠功能恢復。超短波治療在臨床上應用比較廣泛，小劑量超短波可緩解炎癥、提高免疫應答。而膠質(zhì)瘢痕形成是在SCI后發(fā)生免疫反應，激活星形膠質(zhì)細胞后形成的。Yin等[12]通過實驗證明，脊髓損傷后用超短波聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞治療比單純用骨髓間充質(zhì)干細胞或超短波治療功能恢復更好。因此，在聯(lián)合治療組除用ChABC治療外，還加用小劑量超短波治療以觀察能否進一步抑制膠質(zhì)瘢痕的形成及促進大鼠運動功能恢復。然而本實驗的結果顯示，超短波聯(lián)合治療組與ChABC治療組相比，在對CSPGs和GFAP的抑制上，均沒有差異。表明在抑制膠質(zhì)瘢痕形成上，超短波聯(lián)合ChABC治療效果和單純ChABC治療效果沒有統(tǒng)計學差異。因此說明，小劑量超短波治療雖然能緩解炎癥、減輕水腫；但是，對SCI后抑制膠質(zhì)瘢痕形成上沒有明顯治療作用。但是，本實驗對大鼠術后1天以及以后每周一次的運動功能評分觀察結果顯示：雖然術后各組大鼠的運動功能都在恢復，但是在術后1～4周各時間觀察點上，應用超短波聯(lián)合ChABC治療的大鼠肢體功能恢復明顯比對照組的大鼠好。而術后1至3周各時間觀察點上，單純ChABC治療組的大鼠肢體功能恢復相比對照組沒有統(tǒng)計學差異，只是在術后4周明顯超過對照組，以上結果說明ChABC聯(lián)合小劑量超短波治療能更好的促進SCI后的功能恢復，其機制可能與早期抑制膠質(zhì)瘢痕形成有關，但作用不持久，也可能是因為小劑量超短波治療能改善循環(huán)，營養(yǎng)組織，從而促進了神經(jīng)功能恢復，加上用ChABC治療在SCI后又有效的抑制了膠質(zhì)瘢痕形成，為神經(jīng)再生及功能恢復創(chuàng)造了有利條件。因此，超短波聯(lián)合ChABC治療是促進SCI后功能恢復的一個有效治療手段，其具體機制尚不清楚，需要進一步研究。

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