龔文輝，張素梅，儲(chǔ)玨

骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)屬于轉(zhuǎn)化生長因子β蛋白超家族，共由14種蛋白組成，分別對(duì)于不同組織的生理功能發(fā)揮著迥異的調(diào)節(jié)作用[1-2]。BMP7促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化和產(chǎn)熱功能，增加褐色脂肪的產(chǎn)熱功能和總熱量平衡[3-5]。褐色脂肪細(xì)胞能夠利用脂質(zhì)進(jìn)行氧化代謝，增加能量的消耗，減少機(jī)體脂肪堆積[6-7]。研究顯示,褐色脂肪組織能夠增加嚙齒動(dòng)物能量消耗，減少肥胖，緩解飲食誘導(dǎo)的肥胖發(fā)生[8-9]。成年人頸-鎖骨上部存在褐色脂肪庫，部分人胸廓和脊柱旁肌也發(fā)現(xiàn)褐色脂肪，褐色脂肪產(chǎn)熱作用能夠?qū)狗逝值陌l(fā)生[10-13]。本文擬建立飲食誘導(dǎo)的肥胖(diet induced obesity,DIO)鼠模型，觀察下丘腦、肩胛褐色脂肪組織中BMP7表達(dá)，下丘腦產(chǎn)熱功能調(diào)節(jié)酶腺苷酸(adenosine monophosphate，AMP)依賴的腺苷酸活化蛋白激酶(Amp-activated protein kinase,AMPK)表達(dá)，線粒體產(chǎn)熱標(biāo)志物環(huán)氧化酶2(Cycloxygenase 2,COX 2)表達(dá)，以及機(jī)體產(chǎn)熱功能的變化情況，探索運(yùn)動(dòng)影響DIO大鼠產(chǎn)熱功能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性8周齡SD大鼠30只，體質(zhì)量180～200g。

1.2 方法 30只大鼠隨機(jī)分為基礎(chǔ)組10只和DIO組20只，基礎(chǔ)組予標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。①DIO模型制備。采用高脂肪飲食喂養(yǎng)6周制備飲食誘導(dǎo)DIO模型，高脂飼料由87.8%基礎(chǔ)飼料，2%膽固醇，10%豬油，0.2%甲基硫氧嘧啶混合配置[14]，DIO大鼠造模成功標(biāo)準(zhǔn)為體質(zhì)量≥基礎(chǔ)組體質(zhì)量均值加1.4倍標(biāo)準(zhǔn)差[15]。②運(yùn)動(dòng)模型制備。DIO組高脂飼料喂養(yǎng)6周后，隨機(jī)分為安靜對(duì)照組(CO組)和有氧運(yùn)動(dòng)組(EO組)，每組10只；基礎(chǔ)組大鼠作為正常安靜對(duì)照組(C組)。EO組運(yùn)動(dòng)處方：DIO大鼠進(jìn)行8周強(qiáng)度約為70%～75%最大攝氧量的跑臺(tái)訓(xùn)練[16]，適應(yīng)性訓(xùn)練3d后，跑臺(tái)速度15 m/min[16]，每次60 min，每日1次，每周訓(xùn)練5d。4只實(shí)驗(yàn)鼠未能完成運(yùn)動(dòng)干預(yù)，中途退出，最終納入分析的各組實(shí)驗(yàn)鼠數(shù)量均為6只?；A(chǔ)組大鼠保持原生活方式不變。

1.3 指標(biāo)檢測(cè) ①體質(zhì)量、脂體比檢測(cè)：第8周(實(shí)驗(yàn)第14周)訓(xùn)練后斷頭處死大鼠，心臟取血，取雙側(cè)下丘腦組織、肩胛部褐色脂肪、腎周脂肪、附睪脂肪,稱重后液氮保存待檢。脂體比=(附睪脂肪組織質(zhì)量+腎周脂肪組織質(zhì)量)/體質(zhì)量。②靜止代謝率(resting metabolic rate，RMR)、非顫抖性產(chǎn)熱(nonshivering thermogenesis，NST)測(cè)定[17]： RMR測(cè)定以實(shí)驗(yàn)鼠單位時(shí)間內(nèi)單位體重耗氧量表示，采用封閉式流體壓力呼吸計(jì)檢測(cè)；NST測(cè)定以代謝率結(jié)束后30min最大呼吸量為非顫抖性產(chǎn)熱，檢測(cè)前先予去甲腎上腺素溶液(0.2mg/ml)皮下注射，有效劑量與體質(zhì)量相當(dāng)。③褐色脂肪BMP 7、COX 2和下丘腦BMP 7、AMPK蛋白表達(dá)測(cè)定：免疫印記法檢測(cè)蛋白表達(dá)。分別取褐色脂肪提取的100ugBMP 7和COX 2總蛋白，以及取下丘腦提取的100ugBMP 7和AMPK總蛋白，細(xì)胞裂解上清溶解物SDS-PAGE蛋白分離、轉(zhuǎn)膜3h，分別加入1：2000相應(yīng)抗體，洗膜，加1：5000辣根過氧化物酶-抗，曝光、洗片，圖像分析系統(tǒng)定量分析。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量、脂體比變化 實(shí)驗(yàn)第6周，EO組、CO組大鼠體質(zhì)量及脂體比均顯著高于C組(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)第14周，EO組大鼠體質(zhì)量及脂體比明顯低于CO組(P<0.01)。見表1。

表1 3組大鼠實(shí)驗(yàn)第6及14周體質(zhì)量及脂體比比較

與C組比較，aP<0.01；與CO組比較，bP<0.01

2.2 RMR、NST變化 實(shí)驗(yàn)第6周，EO組及 CO組大鼠RMR及NST均明顯低于C組(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)第14周，EO組大鼠RMR及NST明顯高于CO組及C組(P<0.01)。見表2。

表2 3組大鼠實(shí)驗(yàn)第6及14周RMR及NST變化比較 mlO2/(g.h) ，

與C組比較，aP<0.01；與CO組比較，bP<0.01

2.3 大鼠褐色脂肪BMP 7、COX 2蛋白表達(dá)變化 實(shí)驗(yàn)第6周, EO組及CO組大鼠褐色脂肪BMP 7及COX 2蛋白表達(dá)均明顯低于C組(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)第14周，EO組及C組大鼠褐色脂肪BMP 7及COX 2蛋白表達(dá)明顯高于CO組(P<0.01)。見表3。

表3 3組大鼠實(shí)驗(yàn)第6及14周褐色脂肪BMP 7及COX 2蛋白表達(dá)比較 ug，

與C組比較，aP<0.01；與CO組比較，bP<0.01

2.4 大鼠下丘腦BMP7、AMPK蛋白變化 實(shí)驗(yàn)第6周，EO組及CO組大鼠下丘腦BMP 7蛋白表達(dá)明顯低于C組(P<0.01)，AMPK蛋白表達(dá)明顯高于C組(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)第14周，EO組及C組大鼠下丘腦BMP 7蛋白表達(dá)明顯高于CO組(P<0.01)，AMPK蛋白表達(dá)明顯低于CO組(P<0.01)。見表4。

表4 3組大鼠實(shí)驗(yàn)第6及14周下丘腦BMP 7及COX 2蛋白表達(dá)比較 ug，

與C組比較，aP<0.01；與CO組比較，bP<0.01

3 討論

為了探討運(yùn)動(dòng)影響DIO大鼠能量代謝的機(jī)制，本研究進(jìn)一步分析了中樞和外周產(chǎn)熱標(biāo)志物的變化情況。在下丘腦中，運(yùn)動(dòng)能夠顯著增加BMP 7蛋白表達(dá)，降低AMPK蛋白表達(dá)；褐色脂肪BMP 7蛋白表達(dá)，褐色脂肪線粒體功能蛋白COX 2蛋白表達(dá)也顯著增加；總體產(chǎn)熱功能提高，去甲腎上腺素刺激的RMR、NST均顯著增加，體質(zhì)量、脂體比減少。提示運(yùn)動(dòng)影響DIO大鼠能量代謝機(jī)制涉及中樞和外周的BMP7變化，分別在中樞通過改變交感神經(jīng)系統(tǒng)的興奮程度，在外周通過增加褐色脂肪的產(chǎn)熱，調(diào)節(jié)機(jī)體總熱量平衡，最終可能與全身脂肪分布、脂代謝改善及體質(zhì)量下降存在一定聯(lián)系。 研究顯示，BMP 7是褐色脂肪中一種具有調(diào)節(jié)機(jī)體產(chǎn)熱和能量平衡的功能蛋白，隨著褐色脂肪的增加和減少，褐色脂肪中BMP 7的表達(dá)也出現(xiàn)了相同的變化趨勢(shì)，證實(shí)BMP 7表達(dá)可以作為評(píng)價(jià)褐色脂肪功能變化的指標(biāo)[3-4]。以往的研究均認(rèn)為BMP家族在祖細(xì)胞特定的細(xì)胞分化過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[18]。 針對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠的研究[19]顯示：BMP 7 能夠增加機(jī)體能量消耗，治療飲食誘導(dǎo)的肥胖，降低體重。提示褐色脂肪功能變化與全身能量代謝平衡存在直接關(guān)系，并影響體質(zhì)量的增減，為治療肥胖和代謝綜合癥提供了一種新的選項(xiàng)。

本研究中DIO大鼠在第6周體質(zhì)量、脂體比均比基礎(chǔ)對(duì)照組顯著增加。分析原因涉及到了中樞產(chǎn)熱調(diào)節(jié)部位與外周產(chǎn)熱組織功能的改變，證據(jù)來自本研究觀察到的下丘腦和褐色脂肪BMP 7蛋白表達(dá)均顯著下降；褐色脂肪線粒體功能減弱，大鼠去甲腎上腺素刺激的RMR、NST也顯著下降。顯示機(jī)體產(chǎn)熱作用已經(jīng)顯著下降，從而導(dǎo)致脂肪在體內(nèi)堆積，合理地解釋了體質(zhì)量、脂體比的增加機(jī)制。

研究顯示，BMPs不僅僅增加外周褐色脂肪對(duì)腎上腺素刺激的反應(yīng)，還在中樞激活交感神經(jīng)對(duì)褐色脂肪的調(diào)節(jié)作用，在調(diào)節(jié)褐色脂肪產(chǎn)熱作用的中樞部位丘腦下部的腹內(nèi)側(cè)核也發(fā)現(xiàn)了BMPs的表達(dá)[20-21]。長期以來丘腦下部的腹內(nèi)側(cè)核被認(rèn)為是作為攝食中樞，調(diào)節(jié)攝食行為，新的研究又不斷揭示了下丘腦在能量平衡調(diào)節(jié)中的重要作用。通過對(duì)下丘腦能量平衡調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用的AMPK研究，發(fā)現(xiàn)AMPK涉及到外周各種信號(hào)(如胃饑餓素)與下丘腦信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的整合，以利感知急性的血糖變化，以便增加機(jī)體葡萄糖應(yīng)答反應(yīng)的調(diào)節(jié)能力，發(fā)揮了一種“總能量計(jì)量器”的作用，既控制攝食，也調(diào)節(jié)產(chǎn)熱作用[22- 23]。選擇性的下調(diào)下丘腦AMPK，特別是丘腦下部腹內(nèi)側(cè)核內(nèi)的AMPK，能夠增加交感神經(jīng)系統(tǒng)活性，上調(diào)褐色脂肪的產(chǎn)熱能力(產(chǎn)熱標(biāo)志物)，能夠有效地控制諸如如肥胖、甲狀腺功能亢進(jìn)和其它能量代謝紊亂而引起的能量平衡失恒狀態(tài)[20]。

研究發(fā)現(xiàn)，自愿轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)使雌性長爪沙鼠能量消耗水平提高, 運(yùn)動(dòng)開始后運(yùn)動(dòng)組RMR逐漸高于對(duì)照組,至第7周和第8周分別高于對(duì)照組32%和27%[24]。本研究中DIO大鼠給予8周有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，與安靜對(duì)照組相比，去甲腎上腺素刺激的RMR、NST均顯著增加，與Selman等[25-27]的研究結(jié)果一致，并觀察到了體質(zhì)量、脂體比的顯著減少。運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)能量攝入和熱量支出的機(jī)制十分復(fù)雜，褐色脂肪的產(chǎn)熱功能變化研究也有助于解釋運(yùn)動(dòng)影響能量代謝的機(jī)制。褐色脂肪產(chǎn)熱能力的增強(qiáng)常伴隨著線粒體蛋白和線粒體功能基因COX 2活性的增加[28]。在正常人體急性運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，Tete[29]等給予16名研究對(duì)象(男、女各8名)4h 和24h的抗阻訓(xùn)練后COX 2 mRNA表達(dá)顯著增加。作為褐色細(xì)胞產(chǎn)熱參數(shù)，COX 2可以作為評(píng)價(jià)機(jī)體能量代謝的重要指標(biāo)，與解偶聯(lián)蛋白、鳥苷二磷酸、甲狀腺素5，脫碘酶等能夠間接反映褐色脂肪整體功能狀態(tài)[29]。

本研究發(fā)現(xiàn)，DIO大鼠產(chǎn)熱能力顯著下降，體質(zhì)量和脂體比增加，機(jī)制與下丘腦、褐色脂肪BMP 7以及褐色脂肪COX 2蛋白表達(dá)減少有關(guān)。8周有氧運(yùn)動(dòng)能夠增加DIO大鼠產(chǎn)熱能力，降低體質(zhì)量和脂體比，機(jī)制與增加下丘腦、褐色脂肪BMP 7以及褐色脂肪COX 2蛋白表達(dá)有關(guān)。

[1] Reddi AH. Role of morphogenetic proteins in skeletal tissue engineering and regeneration[J]. Nat Biotechnol,1998,16(3): 247-252.

[2] Miyazono K. Signal transduction by bone morphogenetic protein receptors: functional roles of Smad proteins[J]. Bone,1999,25(1): 91-93.

[3] Schleinitz D, Kloting N, Bottcher Y, et al. Genetic and evolutionary analyses of the human bone morphogenetic protein receptor 2 (BMPR2) in the pathophysiology of obesity[J]. PLoS One, 2011,6(2): 155-161.

[4] Tseng YH, Kokkotou E, Schulz TJ, et al. New role of bone morphogenetic protein 7 in brown adipogenesis and energy expenditure[J]. Nature，2008, 454(7207): 1000-1004.

[5] Wang RN, Green J, Wang Z, et al. Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling in development and human diseases[J]. Genes Dis，2014,1(1): 87-105.

[6] Cannon B, Nedergaard J. Brown adipose tissue: function and physiological significance[J]. Physiol Rev, 2004, 84(1): 277-289.

[7] Porter C, Borsheim E, Sidossis LS. Does adipose tissue thermogenesis play a role in metabolic health[J]. J Obes, 2013,23(2): 204-214.

[8] Ghorbani M, Claus TH, Himms-Hagen J. Hypertrophy of brown adipocytes in brown and white adipose tissues and reversal of diet-induced obesity in rats treated with a beta3-adrenoceptor agonist[J]. Biochem Pharmacol,1997,54(1): 121-131.

[9] Bachman ES, Dhillon H, Zhang CY, et al. betaAR signaling required for diet-induced thermogenesis and obesity resistance[J]. Science,2002,297(5582): 843-845.

[10] Cypess AM, Lehman S, Williams G, et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans[J]. N Engl J Med,2009,360(15): 1509-1517.

[11] Saito M, Ogura Y, Matsushita M, et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity[J]. Diabetes,2009,58(7): 1526-1531.

[12] van MLWD, Vanhommerig JW, Smulders NM, et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men[J]. N Engl J Med,2009,360(15): 1500-1508.

[13] Chechi K, Nedergaard J, Richard D. Brown adipose tissue as an anti-obesity tissue in humans[J]. Obes Rev,2014, 15(2): 92-106.

[14] 何曉燁. 高脂飲食在誘導(dǎo)大鼠肥胖及肥胖抵抗中的作用[J]. 中國臨床康復(fù), 2002,19(1): 60-61.

[15] 徐叔云, 陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].第2版. 北京:人民衛(wèi)生出版社，1992, 19-20.

[16] Thomas DP, Zimmerman SD, Hansen TR, et al. Collagen gene expression in rat left ventricle: interactive effect of age and exercise training[J]. J Appl Physiol,2000, 89(4): 1462-1468.

[17] 許婧. 黑腹絨鼠能量代謝對(duì)不同季節(jié)和溫度的響應(yīng)[D]. 浙江師范大學(xué), 2007，34-35.

[18] Tseng YH, Kokkotou E, Schulz TJ, et al. New role of bone morphogenetic protein 7 in brown adipogenesis and energy expenditure[J]. Nature,2008,454(7207): 1000-1004.

[19] Townsend KL, Suzuki R, Huang TL, et al. Bone morphogenetic protein 7 (BMP7) reverses obesity and regulates appetite through a central mTOR pathway[J]. FASEB J, 2012,26(5): 2187-2196.

[20] Lopez M, Varela L, Vazquez MJ, et al. Hypothalamic AMPK and fatty acid metabolism mediate thyroid regulation of energy balance[J]. Nat Med,2010,16(9): 1001-1008.

[21] Morton GJ, Cummings DE, Baskin DG, et al. Central nervous system control of food intake and body weight[J]. Nature,2006,443(7109): 289-295.

[22] Lage R, Vazquez MJ, Varela L, et al. Ghrelin effects on neuropeptides in the rat hypothalamus depend on fatty acid metabolism actions on BSX but not on gender[J]. FASEB J,2010,24(8): 2670-2679.

[23] McCrimmon RJ, Shaw M, Fan X, et al. Key role for AMP-activated protein kinase in the ventromedial hypothalamus in regulating counterregulatory hormone responses to acute hypoglycemia[J]. Diabetes,2008,57(2): 444-450.

[24] 胡振東, 王德華. 自愿轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)條件下雌性長爪沙鼠的體重、能量代謝和血清瘦素含量的變化[J]. 中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志,2007, 15(5): 605-608.

[25] Selman C, McLaren JS, Collins AR, et al. Antioxidant enzyme activities, lipid peroxidation, and DNA oxidative damage: the effects of short-term voluntary wheel running[J]. Arch Biochem Biophys,2002,401(2): 255-261.

[26] Levin BE, Meynell AA. Chronic exercise lowers the defended body weight gain and adiposity in diet-induced obese rats[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,004, 28(4): 771-778.

[27] Gattermann R, Weinandy R, Fritzsche P. Running-wheel activity and body composition in golden hamsters [J]. Physiol Behav,2004,82(2-3): 541-544.

[28] 張志強(qiáng), 劉全生, 李紀(jì)元. 長爪沙鼠褐色脂肪組織和肝臟產(chǎn)熱特征的季節(jié)性變化[J]. 動(dòng)物學(xué)報(bào),2006,(6): 35-37.

[29] Tate TH, Hyek MF. SERCA2a and mitochondrial cytochrome oxidase expression are increased in hearts of exercise[J]. AJP - Heart, 1996,271(1): H68-H72.