苗丹青，徐飛，李軍強(qiáng)，劉婧筠，邵忠琦，朱濤，鐘天鷹

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.江蘇省南京市兒童醫(yī)院 檢驗(yàn)科微生物室，江蘇 南京210008；3.天津康希諾生物技術(shù)有限公司，天津 300457；4.江蘇省南京市婦幼保健院，江蘇 南京 210004）

肺炎鏈球菌是一種重要的人類致病菌，可以引起肺炎、腦膜炎及中耳炎等多種疾病。世界衛(wèi)生組織估計(jì)每年大約有160萬人死于肺炎鏈球菌的感染[1]。肺炎鏈球菌的致病性與其莢膜密切相關(guān)。根據(jù)其莢膜多糖的抗原特性不同，目前已發(fā)現(xiàn)46個(gè)血清群，90余種血清型[2]。但多數(shù)血清型不致病或致病力很弱，僅有少數(shù)致病力較強(qiáng)。故而肺炎鏈球菌血清型流調(diào)是評估多價(jià)疫苗適用性的必要標(biāo)準(zhǔn)[3]。由丹麥血清研究所（Statens Serum Institut,Denmark）開發(fā)的莢膜腫脹和乳膠凝集試劑盒是目前血清型檢測使用的傳統(tǒng)方法，但其抗血清的價(jià)格昂貴且不利于菌株的批量檢測。Pai等[4]開發(fā)的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）分離樣本進(jìn)行血清分型方法提高了分型的效率。近年來，隨著肺炎鏈球菌莢膜多糖的生物合成基因序列的公布，利用分子學(xué)手段進(jìn)行分型的技術(shù)正在逐步走向成熟[5]。

本實(shí)驗(yàn)采用多重PCR的方法，對來自兒童患者體內(nèi)的肺炎鏈球菌的臨床分離株進(jìn)行血清型鑒定，以確定肺炎鏈球菌血清型的分布情況，為13價(jià)肺炎結(jié)合疫苗的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所有323株肺炎鏈球菌臨床分離株均由南京市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室提供，分別于2007年11 月-2011年7月從兒童患者中獲得。其中56株是從患者體液內(nèi)分離得到的菌株，這些患者的臨床診斷結(jié)果約有50%為肺炎，其余的為中耳炎、化膿性腦膜炎等。由于這些菌株來自于患者體內(nèi)，故而為侵襲性菌株。其余的267株是從患者的痰液中分離得到的，為非侵襲性菌株。

含10%羊血的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基（Columbia Blood Agar Base,購自O(shè)XOID）；三磷酸脫氧核糖苷酸（dNTPs）和DNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物購自Invitrogen Trading（產(chǎn)地：上海）其他的化學(xué)試劑均為國產(chǎn)的分析純試劑。

1.2 菌體裂解液的制備

將肺炎鏈球菌的臨床分離株涂布于血平板上，于37℃，5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h[6]。用生理鹽水收集平板上的菌體，混勻，離心。將所得菌體用30 μl TE buffer重懸（10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA,pH 8.0），沸水浴5 min以保證菌體充分裂解，將菌體裂解液于-80℃保存?zhèn)?用[7]。

1.3 PCR方法

用于血清分型的30對PCR引物序列引用參考文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)。以肺炎鏈球菌細(xì)胞裂解液中的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μl，其中包括純化水 15.5 μl，PCR 引物共 2.5 μl，10×buffer 2.5 μl，dNTPs 2 μl，DNA聚合酶0.5 μl，模板DNA（肺炎鏈球菌的菌體裂解液）2 μl。PCR反應(yīng)條件如下：95℃ 4 min，95℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min，最終降溫至4℃。

1.4 PCR產(chǎn)物鑒定

在1.5%瓊脂糖凝膠上對所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，瓊脂糖凝膠的配置和電泳緩沖液菌均采用1×TAE buffer（40 mM Tris-乙酸，1 mM EDTA，pH 8.0）。根據(jù)獲得的DNA條帶大小確定菌株的血清型。

2 結(jié)果

2.1 PCR血清分型的條件優(yōu)化

2.1.1 模板處理方式的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)比較了模板的不同處理方式對PCR結(jié)果的影響，分別以肺炎鏈球菌菌體和菌體裂解液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以14型為例，如圖1所示以全菌體為模板時(shí)第5組引物無產(chǎn)物，第7組產(chǎn)物條帶也較為模糊，而以菌體裂解液為模板時(shí)各組產(chǎn)物均成功擴(kuò)增。結(jié)果表明采用菌體裂解液為模板更有助于肺炎鏈球菌cspA基因的擴(kuò)增。

2.1.2 退火溫度的優(yōu)化 退火溫度是PCR擴(kuò)增是否順利的關(guān)鍵因素，為了比較不同退火溫度對PCR結(jié)果的影響，本實(shí)驗(yàn)將退火溫度分別設(shè)為50℃、52℃和54℃，其他條件不變分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如圖2所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)退火溫度過低（50℃）非特異性條帶較多，對最終血清型的確定產(chǎn)生干擾；退火為52℃或54℃均可特異性擴(kuò)增出肺炎鏈球菌莢膜多糖條帶和分型條帶，但鑒于退火溫度過高特異性過強(qiáng)不利于目標(biāo)條帶的擴(kuò)增，故而將最佳退火溫度設(shè)為52℃。

2.2 樣本血清分型鑒定結(jié)果

此次實(shí)驗(yàn)通過PCR的方法分析了323株肺炎鏈球菌臨床分離株。PCR分型試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。其中血清型19 F、19 A、14和6 A/B型最為常見，所占的百分比分別為31.3%（101/323）、13.3%（43/323）、12.7%（41/323）和10.8%（35/323），有26株未能分型。根據(jù)此鑒定結(jié)果，推斷7價(jià)肺炎結(jié)合疫苗的覆蓋率約為62%，而13價(jià)肺炎結(jié)合疫苗（PCV13）的血清型覆蓋率較高約為85%。

2.3 侵襲性肺炎鏈球菌病例分型結(jié)果

從患者體內(nèi)（包括膿液，血液，腦脊液，胸水，分泌物，胸腔積液，支氣管肺泡灌洗液等）分離得到的菌株，臨床診斷結(jié)果約有50%為肺炎，其余的為中耳炎、化膿性腦膜炎等。來自于患者體內(nèi)的肺炎菌株認(rèn)定為侵襲性菌株。待測樣本中侵襲性菌株共56株，血清分型結(jié)果如圖4所示。其中19 F、14、19 A、3和6 A/B所占比例較高，分別為37.5%、23.2%、10.7%、7.1%和5.4%，其它7個(gè)血清型分別為1、8、17 F、18、20、23 F和33 F，共占16.1%。

非侵襲性菌株共267株，分型結(jié)果如圖5所示。血清型以19 F、19 A、6 A/B、14和3型為主，所占的比例分別為30.0%、13.5%、12.0%、10.5%和5.6%，有26株未能分型。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，患者感染侵襲性肺炎鏈球菌和非侵襲性肺炎鏈球菌的主要血清型相同，均為19 F、14、19 A、3和6 A/B。這5個(gè)血清型共占的比例分別為侵襲性菌株83.9%和非侵襲性菌株71.6%。

圖1 模板的不同處理方式對PCR結(jié)果的影響

圖2 退火溫度的優(yōu)化

圖3 肺炎鏈球菌臨床分離株血清型的分布

圖4 侵襲性肺炎鏈球菌分離株的血清型分布

圖5 非侵襲性肺炎鏈球菌分離株的血清型分布

3 討論

肺炎鏈球菌在自然界中分布廣泛，主要寄生在人的鼻咽部，通過飛沫在人與人之間傳播。約有5%～10%的健康成人及20%～40%兒童的鼻咽內(nèi)帶菌,當(dāng)機(jī)體免疫功能較低時(shí)病菌就會趁虛而入造成肺炎。目前市場上預(yù)防肺炎球菌的疫苗主要有兩大類：23價(jià)肺炎多糖疫苗和7價(jià)多糖蛋白結(jié)合疫苗。這些疫苗的開發(fā)對肺炎鏈球菌類疾病起到了很好的控制作用，但隨著菌株的變異肺炎鏈球菌血清型逐漸增加，現(xiàn)有疫苗覆蓋率不斷降低，且存在地區(qū)差異[8]。肺炎多糖疫苗的成本較高、生產(chǎn)工藝復(fù)雜且多糖疫苗無法保護(hù)嬰幼兒，而2歲以下的嬰幼兒恰恰是的肺炎鏈球菌感染的高危人群，所以肺炎結(jié)合疫苗的開發(fā)將是預(yù)防嬰幼兒肺炎鏈球菌類疾病的主要手段。故而建立一種新的簡便快捷的方法來鑒定各個(gè)地區(qū)的肺炎鏈球菌的血清型，對于評估現(xiàn)有肺炎疫苗的覆蓋率和開發(fā)新的結(jié)合疫苗顯得尤為重 要。

相比于傳統(tǒng)方法連續(xù)多重PCR技術(shù)為肺炎鏈球菌血清型的確定提供了一種更加簡單、經(jīng)濟(jì)的方法，可以更有效地適應(yīng)檢測各個(gè)地區(qū)的血清型，為當(dāng)?shù)胤窝滓呙绲母采w率提供科學(xué)依據(jù)。目前南非、西班牙等多個(gè)國家已采用多重PCR的方法對該地區(qū)兒童和成人患者體內(nèi)的臨床分離株進(jìn)行了血清分型，并選取若干鑒定結(jié)果進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示與mPCR結(jié)果保持一致[9-10]。

本研究建立了多重PCR進(jìn)行肺炎臨床分離株血清分型試驗(yàn)方法，并確定了南京地區(qū)兒童患者所攜帶的肺炎鏈球菌的血清型，為肺炎疫苗的開發(fā)和選擇提供了重要依據(jù)。

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